大学化学, 2018, 33(6): 33-37 doi: 10.3866/PKU.DXHX201801033

化学实验

推荐一个色谱分析实验:高效液相色谱法测定复方醋酸地塞米松乳膏中醋酸地塞米松的含量

高晓慧1, 刘浩然,2

Recommending an Chromatographic Analysis Experiment: Determination of the Content of Dexamethasone Acetate in Mixed Cream by High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

GAO Xiaohui1, LIU Haoran,2

通讯作者: 刘浩然, Email: tom8833@hnu.edu.com

收稿日期: 2018-01-22  

基金资助: 湖南省普通高校“十三五”专业综合改革试点项目.  湘教通[2016]276
长沙医学院校级教改课题.  长医教[2017]44号
湖南大学“校企沟通创新创业基地”基金

Received: 2018-01-22  

Fund supported: 湖南省普通高校“十三五”专业综合改革试点项目.  湘教通[2016]276
长沙医学院校级教改课题.  长医教[2017]44号
湖南大学“校企沟通创新创业基地”基金

摘要

推荐了用高效液相色谱法测定复方醋酸地塞米松乳膏中醋酸地塞米松含量的实验,综合了称量、热水浴、涡旋、冰浴、过滤、移液等多种样品前处理实验技能,又涉及紫外分光光度计、高效液相色谱仪两种分析仪器,并使学生掌握色谱定量测量的方法学及数据处理方法。此实验能全面锻炼学生的实验技能,增强其实践应用能力,并培养其初步的科研思维。

关键词: 推荐 ; 醋酸地塞米松 ; 高效液相色谱 ; 冰浴 ; 乳膏

Abstract

This paper recommended the experiment of "Determination of the content of dexamethasone acetate in mixed cream by high performance liquid chromatography", in this experiment several experimental skills such as weighing, hot water bath, vortex, ice bath, filtration, liquid transfer and other sample pretreatment skills are included, and UV spectrophotometer and HPLC are used, as well as the methods of quantitative measurement and data processing are requested to get. This experiment can fully promote the students' experimental skills, enhance the ability for practical application, and raise the preliminary scientific research thinking.

Keywords: Recommend ; Dexamethasone acetate ; HPLC ; Ice bath ; Cream

PDF (5970KB) 元数据 多维度评价 相关文章 导出 EndNote| Ris| Bibtex  收藏本文

本文引用格式

高晓慧, 刘浩然. 推荐一个色谱分析实验:高效液相色谱法测定复方醋酸地塞米松乳膏中醋酸地塞米松的含量. 大学化学[J], 2018, 33(6): 33-37 doi:10.3866/PKU.DXHX201801033

GAO Xiaohui, LIU Haoran. Recommending an Chromatographic Analysis Experiment: Determination of the Content of Dexamethasone Acetate in Mixed Cream by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). University Chemistry[J], 2018, 33(6): 33-37 doi:10.3866/PKU.DXHX201801033

高等学校中仪器分析实验难度大、涉及内容多,且常常由于各种原因难以达到应有的教学效果[1]。色谱分析实验是仪器分析中难度相对较大的一种[2]。跟光谱类相比,色谱是一种分离分析技术,擅长分析复杂的物质体系。如何设计色谱分析实验,既取决于高校自身的实验条件,又与实验教师的教学理念密切相关。以高效液相色谱(HPLC)为例,不少高校的高效液相色谱实验只开设了基础型实验,基本上沿袭了一些经典的相对简单的实验[3],如:“HPLC测定苯、萘、菲、联苯混合物”“HPLC测定可乐中的苯甲酸钠和咖啡因”等。这些实验主要注重仪器的操作技能,前处理相对简单,无法对学生进行较为全面的锻炼和培养。因此,很有必要在综合实验或专业实验中让学生通过对复杂混合物的测定来掌握相关技能,提升实践应用能力。

笔者在多年的实验教学中以提高学生应用能力为核心理念,不断摸索和创新,自2009年起开设了一个新的色谱分析实验:HPLC测定复方醋酸地塞米松乳膏中醋酸地塞米松的含量,取得了良好的教学效果,可供化学、药学及相关专业本科生实验教学采用。推荐如下。

1 实验目的

(1)巩固HPLC操作;(2)熟悉样品的前处理过程,掌握乳膏类样品的处理技能,即热水浴、涡旋、冰浴、过滤、移液等;(3)熟悉复杂样品的HPLC条件摸索方法;(4)熟悉HPLC含量测定的数据处理方法和过程;(5)熟悉检验报告的书写格式;(6)能运用本实验中的技能和理念进行其他相关实验。

2 实验原理

复方醋酸地塞米松乳膏中含有三种药物:醋酸地塞米松、薄荷脑、樟脑。乳膏基质组成为:凡士林、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、二甲亚砜、甘油、十二烷基硫酸钠、尼泊金乙酯(即对羟基苯甲酸乙酯,在乳膏中作防腐剂)等。处方中大部分基质可通过前处理去除,仅防腐剂尼泊金乙酯有较强的紫外吸收,但采用HPLC法可将尼泊金乙酯与醋酸地塞米松分开,从而测定后者的含量。

3 仪器与试剂

3.1 仪器

高效液相色谱仪:二元高压输液泵、紫外检测器、柱温箱、进样器、脱气机;微量进样器(100 μL);微孔滤膜(聚偏氟乙烯膜或尼龙膜,0.22 μm);过滤装置;漩涡混合器;超声波清洗器;容量瓶(100 mL,50 mL)。

3.2 试剂与材料

醋酸地塞米松对照品,购于中国生物制品药品检验研究院;复方醋酸地塞米松乳膏,市售品;甲醇,色谱纯;超纯水,自制。吸管;冰袋;一次性注射器;一次性PE样品管。

4 实验步骤

4.1 醋酸地塞米松和尼泊金乙酯的紫外-可见光谱测定

测定醋酸地塞米松在240 nm左右有最大吸收波长,而尼泊金乙酯在240 nm处有严重干扰(图1,但其干扰可通过HPLC的分离而排除。故选择240 nm为检测波长。

图1

图1   醋酸地塞米松及尼泊金乙酯的紫外-可见光谱


4.2 色谱条件的确定

色谱柱:Kromasil C18柱(4.6 mm × 150 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(70 : 30);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:240 nm;柱温:32 ℃;进样量:20 μL;本实验中色谱柱为最常用的C18键合硅胶反相色谱柱,此规格的色谱柱其流动相流速以1.0 mL·min-1为最佳。柱温常选择25-35 ℃。我们一般用32 ℃,但亦可调整。反相色谱流动相一般为甲醇或乙腈与水组成。本实验中我们告知学生的规律是:流动相中有机相比例越高,其保留时间越短,但亦可能无法将混合物分开。因此摸索流动相比例时我们通常由较高比例的有机相向较低比例摸索,直至出现较为满意的结果。图2中A、B、C即是分别采用甲醇:水= 90 : 10、80 : 20及70 : 30时所获得的样品色谱图。可见图中C的结果较为理想。

图2

图2   醋酸地塞米松乳膏样品、空白乳膏样品及醋酸地塞米松对照品的色谱图

(A)、(B)、(C)依次是流动相为甲醇:水= 90 : 10、80 : 20及70 : 30时的样品色谱图;(D)空白乳膏样品的色谱图;(E)醋酸地塞米松对照品的色谱图。图中1为尼泊金乙酯,2为醋酸地塞米松


4.3 溶液的配制

4.3.1 对照品溶液的配制

精密称取醋酸地塞米松对照品15.0 mg,置于100 mL容量瓶中,先加甲醇70 mL溶解,再加甲醇稀释至刻度,即成浓度为150 μg·mL-1的对照品贮备液。分别精密量取醋酸地塞米松对照品贮备液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mL置于50 mL容量瓶中,再用甲醇稀释至刻度,分别配制成醋酸地塞米松浓度为6.0、15.0、30.0、45.0、60.0 μg·mL-1的对照品溶液。实际测量时对照品溶液的浓度不拘泥于上述数值,可适当变化,只要在线性范围内即可。每个浓度之间的间隔并不一定要完全等距,大体均匀即可。

4.3.2 供试品溶液

精密称取1.5000 g乳膏(约相当于醋酸地塞米松1.125 mg)置于150 mL锥形瓶中,加甲醇25 mL,以保鲜膜封口,加橡皮筋箍紧,保鲜膜上用针扎几个小孔,置82 ℃水浴上使熔融(图3A)。待乳膏完全熔融后(2-3 min左右即可),将锥形瓶置涡旋混合器上振荡混合2 min (图3B),再置冰浴冷却1.5 h (图3C)。滤纸过滤(图3D),用23 mL左右的甲醇分三次洗涤锥形瓶和滤器,滤液收集于50 mL容量瓶中,加甲醇定容。以注射器吸取上述滤液适量,套上一次性微孔过滤头过滤(图3E),取续滤液置于2.5 mL一次性PE样品管(俗称“子弹头”)中,即为供试品溶液。说明:市售品乳膏含醋酸地塞米松标示量为0.75 mg·g-1。乳膏基质一般在80 ℃水浴可熔融,考虑到水浴锅与锥形瓶内的温度差,采用82 ℃水浴。冰浴1.5 h以上基质可完全析出。

图3

图3   前处理操作

(A)热水浴;(B)涡旋;(C)冰浴;(D)过滤;(E)微孔滤膜过滤


4.3.3 阴性对照供试品溶液的配制

自制不含醋酸地塞米松的空白对照乳膏。精密称取空白基质1.500 g,按供试品溶液的配制方法制备空白对照溶液备用。说明:此步骤主要是为了突出乳膏基质及附加剂对测定的影响,从而为确立色谱条件提供依据。此步骤药学专业学生可选做,化学专业学生可不做。

4.4 标准曲线的建立

按上述色谱条件,取对照品溶液分别进样20 μL,记录色谱图。以醋酸地塞米松浓度(c)为横坐标,以样品峰面积(s)为纵坐标,用Excel软件进行线性回归,得标准曲线。

4.5 干扰性试验

取30 μg·mL-1的对照品溶液,用0.22 μm微孔滤膜过滤,进样20 μL,记录色谱图(图2E);另分别取空白基质乳膏(图2D)及复方醋酸地塞米松乳膏供试品溶液(图2C),按上述步骤进样,记录色谱图。在醋酸地塞米松保留时间内,应无杂质峰干扰。

4.6 样品的测定

取供试品溶液,以微量进样器进样20 μL,记录色谱图。每个样品进样5次。根据样品所得的相对峰面积求算药物的浓度。

4.7 撰写检验报告

实验完毕,简述实验过程、分析实验数据,写出实验心得,整理成实验报告。药学专业学生除按要求撰写常规的实验报告之外,还需按药品检验报告的特定格式提交一份报告。

5 讨论

本实验的设计思想是:将前处理、定性与定量分析、数据分析、撰写报告等过程综合起来,让学生对分析实验的全过程有深刻的认识。本实验可让学生有如下收获。

(1)高效液相色谱对复杂物质的测定并不是万能的,在测定之前要利用药物与其他药物及基质在物理化学性质方面的差异排除干扰[4]。本实验就是利用基质在高温下熔融而低温下析出的特点采用冰浴法去除。乳膏中的另两种药物薄荷脑和樟脑对测定无干扰,防腐剂尼泊金乙酯虽有紫外吸收干扰,但可通过HPLC分离而排除。测定其他乳膏类药物或化妆品时亦可借鉴此实验的方法。

(2)高效液相色谱法测定混合物时是需要摸索条件的。此实验我们只告知学生规律,而由其自行摸索色谱条件。其基本原则是“出得来”(目标峰能出来)、“分得开”(目标物质与其他成份能分开)、“跑得快”(在分离度较好的情况下尽可能缩短保留时间,从而缩短分析周期)。本实验相对于中国药典中的方法有两处改变。一是将冰浴时间由原来的2 h缩短至1.5 h,节约时间但不影响实验结果。二是将原内标法改为外标法,减少了步骤和复杂程度。以定量环定量,亦不影响实验结果。

(3)本实验有助于学生今后从事药物分析及其他类似的工作。化学专业有不少学生从事药物分析方面的工作。学会了高效液相色谱技能亦可应用于环境检测、食品检测等诸多相关行业[5, 6]。复方醋酸地塞米松旧称“皮炎平”,是上世纪80年代以来一直常用的药物。大多数学生及家人对此药都非常熟悉,能运用自己所学的知识与技能亲自测定此药的含量,学生倍感亲切和自豪。

本实验可供化学、药学及相关专业学生实验教学选用。推荐教学时数为6学时。推荐实验成绩评定方法:样品前处理,占40%;色谱条件摸索及样品测定,占40%;数据分析及实验报告撰写,占20%。

参考文献

何隽; 艾洪莲; 冯涛; 李正辉; 吴滨; 刘吉开. 鞍山师范学院学报, 2016, 18 (6), 59.

URL     [本文引用: 1]

高晓慧; 刘英姿; 刘浩然; 夏新华. 教育教学论坛, 2016, 8 (43), 262.

[本文引用: 1]

刘浩然. 大学化学, 2017, 32 (5), 25.

[本文引用: 1]

徐霞; 袁荷芳; 顾成鹏; 倪嘉倩. 现代食品, 2016, 2 (17), 98.

URL     [本文引用: 1]

吴藻光. 环境研究与监测, 2011, 24 (1), 53.

URL     [本文引用: 1]

沙娇; 李涛; 任保增. 河南化工, 2016, 33 (8), 15.

URL     [本文引用: 1]

/