氨基酸作为构成生命体的最为重要的小分子单元,其合成与分解代谢理所应当作为生物化学课程的讲授重点,以便被生命科学与化学生物学相关专业的本科生所掌握^[1]。然而,由于20种天然氨基酸具有结构迥异的侧基官能团,其代谢过程也极具特色和相对的独立性,氨基酸代谢相关的内容在国内外高校本科教学中常处于盲区。这对于在生命科学和化学蓬勃发展的21世纪培养新型跨学科人才极为不利。为了解决这一长期存在的问题,笔者分析需要从内容和方式等多方面进行教学改进。考虑到氨基酸代谢与糖酵解、三羧酸循环和脂肪酸代谢等不同,具有相对复杂的过程、涉及酶类和辅酶众多、涵盖大量的代谢通路^[2]等特点,故而不能简单顺着代谢路径一步一步机械性地推进讲解。相反,应该更多从有机化学原理共性的角度出发归纳总结。

本文将以三种最为基本的天然氨基酸——异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)为例分析讨论代谢过程,并为教学提供一种可能的探索模式。需要注意的是,这三种氨基酸虽然都具有看似简单的非极性侧链结构,但实际上要形成这些烷基侧链极为困难,生命体系也采取了很多不寻常的反应和机制,可谓出其不意乃至令人"大跌眼镜"^[3]。通过结合有机化学、酶学、结构生物学、生物物理学等其他学科,详细分析乙酰乳酸合成酶催化缩合反应与乙酰羟基酸异构还原酶催化的烷基迁移-还原反应,将有机化学中典型的"安息香缩合"反应和"频哪醇重排"反应进行类比,讨论了极性翻转、1, 2-烷基迁移和席夫碱催化三类重要化学过程,及硫胺素、金属阳离子和吡哆醛三类重要辅酶的催化过程。进一步分析了生命体系采取这样代谢途径以构建碳链骨架的原因和逻辑。学习和了解相关过程充满了探索性和趣味性。对于这些本科生难以通过自学而深刻理解或掌握的内容进行详细分析讨论,可以理清相关氨基酸合成代谢的脉络。相关内容的教学不仅可以让学生了解很多基本的化学和酶学原理,亦能反映一些深刻的生物化学本质与原理^[4]。这对于学生后续的深入学习与研究都有深远意义。此外,由于这些代谢过程中涉及到的酶类和相关代谢中间体仍然是目前的研究热点^[5],深入挖掘氨基酸代谢的相关内容也为学生今后的相关专业研究做好知识积累。不失为一种基础教育与前沿科学接轨的新型模式^[6]。

20种天然的蛋白质氨基酸的合成一般都从某些代谢中间体起始并进行多步骤转化而得,并与主要代谢途径共同构成代谢网络。氨基酸的合成一般最后一步都是通过对应α-酮酸经过生物转氨反应形成,故而不同氨基酸的差异性主要表现在侧链基团R上。具有同类侧链的氨基酸一般起始于相同的原料,经历类似的过程,但也各有所差异。以四种非极性烷基R侧链的氨基酸为例,它们均来自糖酵解产物丙酮酸,包含简单的丙氨酸(R为甲基)、缬氨酸(R为异丙基)、亮氨酸(R为异丁基)和异亮氨酸(R为仲丁基,二级丁基)。从基础有机化学知识可知,由于稳定的碳-碳单键,烷基作为最为惰性的官能团,在化学反应中难以形成或断裂,这也使得对于这些氨基酸侧链的构建成为一个有机化学难题。

对于不同物种,其合成天然氨基酸的能力大不相同。例如,大部分细菌和高等植物能合成所有的20种天然氨基酸,而哺乳动物只能通过相对简化的路线合成约一半,被称为"非必需氨基酸"。另外的一半则通过饮食摄取,成为"必需氨基酸"。很不幸的是,这4个非极性氨基酸中除了最简单的丙氨酸外,哺乳动物均无法自主合成。要想深刻认知此问题,我们需要从这3个氨基酸的合成入手进行分析探讨,比较并讨论其中的异同。

缬氨酸是这3种氨基酸中相对简单的一种。这里的简单,一方面是其侧链只有3个碳原子而非亮氨酸或异亮氨酸的4个碳原子;另一方面,其合成的唯一主要原料为两分子的丙酮酸。所以我们以其为代表路径进行逐一分析。缬氨酸(Valine)的化学命名法为α-氨基异戊酸,故而也具有与戊酸(Valerate)相关的词根。按照上文分析我们可以得出的第一个结论是最后一步反应一定是α-羰基异戊酸(图1A4)的转氨反应。所以核心在于如何合成α-羰基异戊酸。

两分子的丙酮酸(图1A1)首先在乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,酶a)的催化下缩合转化为α-乙酰乳酸(图1A2),然后在乙酰羟基酸异构还原酶(Acetohydroxy acid isomeroreductase,酶b)催化下发生甲基迁移异构化反应并还原,最终形成α, β-二羟基异戊酸(图1A3)。α, β-二羟基化合物不稳定,在二羟基酸脱水酶(Dihydroxy acid dehydratase,酶c)作用下脱水形成前体α-羰基异戊酸(图1A4),最终在缬氨酸转氨酶(Valine aminotransferase,酶d)催化下以谷氨酸为供体形成缬氨酸^[7]。

其中,除去末步转氨反应是所有氨基酸合成的必经之路以及脱水反应的一步,该路径一共还涉及两个酶促反应步骤。令人惊讶的是,这两个步骤都具有非常复杂的过程,让人不由得佩服于自然界的创造力。本文将着重在第3部分详细探讨。

在分析了缬氨酸的合成路径后,我们来概观性地考查第二个非极性氨基酸异亮氨酸(Isoleucine)。一分子丙酮酸(α-羰基丙酸)在乙酰乳酸合成酶(酶a)催化下与α-羰基丁酸缩合形成α-乙酰-α-羟基丁酸(图1B5),其中α-羰基丁酸来源于苏氨酸(后文将详述),而苏氨酸的合成则是以草酰乙酸经转氨反应形成的天冬氨酸为原料。α-乙酰-α-羟基丁酸随后在乙酰羟基酸异构还原酶(酶b)催化下发生类似的乙基迁移异构化反应并还原,最终形成α, β-二羟基-β-甲基戊酸(图1B6),进而在二羟基酸脱水酶(酶c)作用下脱水形成前体α-羰基-β-甲基戊酸(图1B7),最终在缬氨酸转氨酶(酶d)催化下以谷氨酸为供体形成异亮氨酸。

从与缬氨酸合成路径的比较可以看出,二者在合成路径上极其相似,使用完全一样的酶类和机制,仅有第一步的区别。这也就可以解释为什么酶b和酶c在命名上并没有遵循一般的"底物+反应机制酶"或者"产物合成酶"的原则称为"α-乙酰乳酸异构还原酶"和"α, β-二羟基异戊酸脱水酶",而分别被称为"乙酰羟基酸异构还原酶"与"二羟基酸脱水酶",正说明他们对于底物的选择性较低,侧基衍生化具有较高的容忍度。

分析了缬氨酸与异亮氨酸这对孪生兄弟后,我们再来探究亮氨酸(Leucine),显而易见,其直接的转氨反应前体是α-羰基异己酸(α-Ketoisocaproate, 图1C10)。亮氨酸合成路线前三步和缬氨酸完全一样,直到形成α-羰基异戊酸为止。α-羰基异戊酸在α-异丙基苹果酸合成酶(α-Isopropylmalate synthase,酶e)作用下形成α-异丙基苹果酸(图1C8),进而在异丙基苹果酸异构酶(Isopropylmalate isomerase,酶f)作用下发生羟基迁移形成β-异丙基苹果酸(图1C9)。所得产物在β-异丙基苹果酸脱氢酶(β-Isopropylmalate dehydrogenase,酶g)的作用下发生氧化脱羧反应形成α-羰基异己酸(图1C10)并在亮氨酸转氨酶(酶h)的催化作用下发生转氨反应。这几个步骤机制在此略过^[8]。

前文主要探讨了以缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸为代表的三种氨基酸的合成代谢路径,分步骤阐述了其中的底物、产物及对应的酶。为了深刻认识其中的有机化学机理和生物化学原理,并理解自然界设计这样的合成路线的原因,我们还需要进一步了解反应机制,并归纳总结。如2.1和2.2部分所述,缬氨酸与异亮氨酸分享了几乎完全相同的代谢过程。该过程四步反应中的后两步机制从有机化学的角度看都非常容易实现,酶也只需要单纯地提供一些酸碱催化即可。然而,前两步却极有玄机,需要在教学中进行额外的系统性分析。

我们首先着眼于乙酰乳酸合成酶(酶a)催化进行的酮酸-酮酸缩合反应。这里以异亮氨酸合成中2-丁酮酸与丙酮酸反应生成α-乙酰-α-羟基丁酸为例。该过程从表观看来似乎是一个丙酮酸分子在酶的作用下首先脱羧形成羰基负离子,进而作为亲核试剂直接进攻2-丁酮酸的α-羰基形成碳-碳键联即可得到产物(图2A)。从有机化学的角度分析,这个过程中最关键且最有挑战性的一步是丙酮酸的脱羧反应。相比于非常容易发生脱羧反应的β-酮酸, α-酮酸的脱羧反应就要难发生很多,其中一个重要原因就是α-酮酸脱羧后会生成极不稳定的羰基负离子中间体。

从基础有机化学即熟知,羰基作为电正性中心具有极强的亲电性,更难以自发脱羧去进攻另外一个分子的羰基。这一看似难以实现的过程正是有机化学中极为重要的"极性翻转"策略^[9],即将一个典型的亲电性基团如羰基转化为一个亲核性基团。在有机化学中,人们通过在羰基上引入一个强的吸电子基团使得碳原子携带负电荷的异构体离子更加稳定而非氧原子。例如,著名的"安息香缩合"反应(Benzoin condensation)中就以氰离子作催化剂^[10]。生命体系中也有这样的替代品,正是硫胺素类(维生素B1)。由于噻唑环的缺电子性及本身的芳香性导致其可以良好地通过离域效应分散环上所带的电荷,并通过共振式分散其取代基上可能的电荷(图2B11)。

因此,在这一步反应中,硫胺素参与的主要目的便是稳定丙酮酸脱羧后的乙酰碳负离子中间体。该反应更为详细的反应机理如图2C所示。首先,丙酮酸的羰基被硫胺素进攻,形成中间体12。随后,中间体12发生脱羧反应,形成的羰基碳负离子13具有共振式结构。由于噻唑环的缺电子性,该羰基碳负离子在噻唑环的共振作用下得以稳定,并进攻2-丁酮酸得到中间体14。随后,硫胺素再从中间体14中消除得到产物α-乙酰-α-羟基丁酸^[11]。

除了极性翻转碳负离子进攻羰基形成碳-碳键外,自然界还采用另外一类常见的反应重构碳链结构,那就是异构化反应^[12]。异亮氨酸合成的第二步即是一个典型的异构化反应。在该步骤中, α-乙酰-α-羟基丁酸(图1B5)在乙酰羟基酸异构还原酶(酶b)催化下发生乙基迁移并还原的反应,最终形成α, β-二羟基-β-甲基戊酸(图1B6)。

有机化学中的重排反应一般利用不同取代基碳正离子的稳定性差异,而阴离子的1, 2-烷基迁移相对于碳正离子重排是更为困难的过程^[13]。例如,著名的"频哪醇重排"(Pinacol rearrangement)利用邻位的碳正离子的不稳定性,直接推动烷基负离子迁移^[14]。要实现类似过程,自然界需要形成并稳定烷基碳负离子,并推动迁移,这都是由该酶活性位点所包含的两个金属镁离子实现^[15]。金属离子具有高的离子势,携带两个正电荷,半径小,具有强的正电荷电场^[16]。通过与底物α-羟基及β-羰基配位,可以起到两个作用:其一,镁离子可以极化α-羟基,这是形成并稳定负离子的保证;其二,镁离子可以极化β-羰基,增加邻位羰基的亲电性和不稳定性,这是驱动碳负离子迁移的直接动力。

考虑到所形成的产物仍然是β-羟基及α-羰基的结构,该重排反应理论上应该可以按照相同的过程逆向进行,即作为平衡存在。为了推动反应的持续进行,自然界巧妙地赋予了这个酶另一个功能,即直接利用NADPH将α-羰基还原。利用有机化学中的"反应偶联"的效应推动1, 2-烷基迁移的平衡正向移动。

故而,该反应的机理分为迁移与还原两个阶段。首先, α-乙酰-α-羟基丁酸进入酶的活性位点(图315)并取代与镁离子配位的水分子形成酶-底物配合物(图316)。随着α-羟基失去质子,氧原子上的负电荷转移到乙基上推动其迁移并进攻β-酰基(图317),形成碳-碳键后重新质子化(图318)形成α-羰基-β-羟基-β-甲基戊酸中间体(图319)。第二阶段在NADPH的作用下还原形成产物α, β-二羟基-β-甲基戊酸(图320)并脱离酶的活性位点^[17]。值得注意的是,异亮氨酸是唯一一个具有两个手性中心的氨基酸,在本文中不涉及。

对于缬氨酸和基于缬氨酸的亮氨酸而言,其合成代谢的原料是细胞内大量存在的丙酮酸。但是对于异亮氨酸,其第一步反应的原料之一2-丁酮酸(图4B21)却须由苏氨酸在苏氨酸水解酶(Threonine dehydratase, 图4酶i)的催化下转化而得。从反应物和生成物结构分析,此过程是一个看似简单的脱水并脱氨反应生成了相应的酮酸,也以磷酸吡哆醛为辅酶,这与氨基酸的转氨反应或者脱氨反应看似非常类似^[18]。然而,与一般的由磷酸吡哆醛参与的转氨反应中氨基氧化为羰基不同的是,从整个分子层面上该反应从反应物到产物并没有发生氧化态的改变。α-碳和β-碳的氧化态发生了歧化,即苏氨酸的α-碳从氨基取代到被氧化为α-酮基,去还原了β-碳使得羟基得以离去,而非通过磷酸吡哆醛为媒介转移到了其他的酮酸或者NAD (P)⁺中,因此具有特殊的机理。

该反应的机理如图4所示,在初始状态(图4B25)下磷酸吡哆醛以席夫碱(Schiff base)的形式结合在酶的活性位点的第51号赖氨酸残基上。苏氨酸进入活性位点后取代赖氨酸残基与磷酸吡哆醛形成了新的席夫碱(图4B22),从而活化了苏氨酸的α-氢原子。该α-氢原子随即转移到碱性的赖氨酸残基上,而吡啶环异构化形成醌式结构中间体(图4B23)。随后醌式结构转变回吡啶式结构并使得β位的羟基离去,形成了新的席夫碱(图4B24)。此时赖氨酸残基再次进攻此席夫碱以释放产物并重置活性位点,而从磷酸吡哆醛上脱落下的2-氨基-2-丁烯酸(图4B26)则会由烯胺式结构互变异构为亚胺式结构的α-亚氨基丁酸(图4B27),并在从酶的活性位点释放后水解为最终产物2-丁酮酸。

由此机理可见,酶所发挥的作用仅仅是"脱水",而脱氨的步骤则完全是由酶所释放出的产物α-亚氨基丁酸自发水解完成。辅酶磷酸吡哆醛在反应中所发挥的作用也主要是与苏氨酸形成席夫碱活化α-氢原子,并不会接受苏氨酸的电子形成吡哆胺,这与之前基于反应物与产物的氧化态所做出的整体分析相符。虽然磷酸吡哆醛起到的作用与其他磷酸吡哆醛参与的反应中所起的作用并不完全一致,但在帮助活化底物氨基酸的α-氢原子这一点上却是一致的。可见生命体系再复杂,反应类别再独特,仍然是遵循基本的化学准则且有规可循的。

上文详细阐述了在三种非极性氨基酸合成过程中的三个代表性酶的作用机制和催化反应历程。下面我们对其中三个问题进行简要分析。

在机理探讨中,我们重点分析了活性位点中几种辅酶在催化中的作用。然而,酶本身在其中除了提供活性位点的"口袋"外更是有着不可替代的作用^[19]。酶的第一个作用是结合并稳定辅酶,这是保证酶促反应进行的基础。乙酰乳酸合酶(酶a)的晶体结构也给其催化机理提供了印证(图5A)。以枯草杆菌的乙酰乳酸合酶为例,该活性位点处在酶内部疏水核心,有相应的通道使产物和反应物能进出酶的活性位点。硫胺素二磷酸(图2B11)在酶的活性中心通过非共价作用与酶结合。包括活性位点中的镁离子与硫胺素二磷酸上的两个磷酸基团、一个水分子,附近的两个天冬氨酸残基和一个肽链骨架上的酰胺羰基形成的八面体六配位结构,以及硫胺素嘧啶环与周围氨基酸残基的氢键相互作用,对于稳定辅酶行使功能必不可少。在乙酰羟基酸异构还原酶(酶b)中也同样能够看到酶与底物、镁离子和辅酶NAD⁺分子的紧密作用(图5B)^[20]。

酶的第二个主要作用是容易受到调控,包括数量调控与活性调控。作为异亮氨酸合成代谢的重要步骤,苏氨酸脱水酶(图4酶i)受到异亮氨酸的负反馈调节,而缬氨酸则可以抵消异亮氨酸对其的抑制^[21]。这种反馈调节作用是生物体对各种代谢进行调控的基础。当异亮氨酸浓度升高时,苏氨酸脱水酶活性受到抑制,使得异亮氨酸合成减慢,从而避免异亮氨酸在细胞内过多积累。另一方面,当缬氨酸浓度升高时,缬氨酸又会"重启"苏氨酸脱水酶的活性,使得缬氨酸和异亮氨酸的比例不至于失衡。此外, pH对苏氨酸脱水酶的活性也有很大影响^[22],这些都构成了细胞对氨基酸合成代谢的复杂调控系统的一部分。

苏氨酸脱水酶由4个相同的亚基构成,每个亚基上有两个结构域,一个具有催化活性,另一个负责别构调节。在具有催化活性的结构域上,晶体结构清晰展示磷酸吡哆醛在酶的活性位点的结合方式,磷酸吡哆醛通过结合位点的赖氨酸残基形成席夫碱共价键联在酶上(图5C)。吡啶环与附近的苯丙氨酸残基也有疏水相互作用,吡啶环上的氮原子则与附近的丝氨酸和苏氨酸残基有氢键相互作用,而磷酸基团则与结合位点另一侧的甘氨酸骨架存在氢键相互作用。但苏氨酸如何结合还并不完全明晰。在负责别构调节的结构域上,存在两个别构调节位点,分别为Y543和Y449(大肠杆菌苏氨酸脱水酶)。Y449在结合了异亮氨酸后,引起蛋白质构象变化,使得Y543对异亮氨酸的结合能力变强。Y543结合异亮氨酸后会再次引起蛋白质构象变化,导致酶对底物苏氨酸的结合能力下降。而Y449在结合了缬氨酸之后,则会导致不同的蛋白质构象变化,使得Y543对异亮氨酸的结合能力变弱,从而抵消了异亮氨酸对酶活性的抑制作用^[23]。

乙酰乳酸合成酶催化缩合反应的核心就在于,硫胺素对羰基碳负离子的稳定作用使得丙酮酸的脱羧过程易于进行。极性翻转以实现碳负离子偶联是一种自然界大量使用的碳-碳键构建策略。除了在亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸这三种氨基酸的合成代谢中,硫胺素作为辅酶时在各种生化反应中也都被广泛使用,并发挥着类似的作用。例如在丙酮酸的氧化脱羧生成乙酰辅酶A以及丙酮酸的简单脱羧生成乙醛的过程中都有硫胺素的参与,且反应机理也都大同小异^[24]。在具体教学中,我们可以复习硫胺素的作用机制,并归纳一下通过硫胺素实现极性翻转的其他典型酶类。这也再次映证了尽管生命体各种代谢反应广泛多样,但如果从反应机理的层面分析,就可以更方便地归类,在学习中也更容易做到触类旁通。

本文以异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸三种天然氨基酸为例讨论分析了其合成代谢具体过程的相似性和差异性。这三种氨基酸虽然具有相似的非极性侧链,但由于生命体内合成烷基侧链的难度而存在不同的反应和机制。通过结合有机化学、酶学、结构生物学、生物物理学等其他学科,笔者以"安息香缩合"反应和"频哪醇重排"反应分别类比讨论了乙酰乳酸合成酶催化缩合反应与乙酰羟基酸异构还原酶催化的烷基迁移-还原反应,讨论了极性翻转、1, 2-烷基迁移和席夫碱催化三类重要过程,以及硫胺素、镁离子和吡哆醛三类重要辅酶的催化过程。进一步分析了生命体系采取这样代谢途径以构建碳链骨架的原因和逻辑。

深刻理解相关氨基酸合成代谢的过程和机制,不仅反映出一些深刻的化学本质和原理,也是一种新的从内容和形式上对教学改革提供的一种可能的探索模式^[25]。对氨基酸合成代谢的共同性和特异性的分析,以增加这些单调的生化反应的趣味性和启发性。在深入了解酶学和生化反应原理的同时,学生学习目前研究热点涉及到的酶类及相关代谢中间体^[26],对培养21世纪化学与生命科学新型跨学科人才是极其重要的^[27]。