糠醛类化合物是由富含糖类的物质经热加工致使糖降解，或氨基酸、蛋白质与还原性糖发生美拉德反应产生的一类化合物，主要包括糠醛(F)、5-甲基糠醛(5-MF)和5-羟甲基糠醛(5-HMF)这三种化合物。当食品中糠醛类化合物的含量处于较低水平时，可以使食品产生令人愉悦的风味，但当其含量过高时，会导致食品变质，从而影响食品的新鲜度和食用者的身体健康，甚至导致食用者罹患癌症。因此，食品中的糠醛类物质的检测已经引起越来越多的关注，在消费者保护和食品质量控制方面显得极其重要^[1–5]。

目前，糠醛类化合物的检测方法包括分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱-紫外检测法等。上述方法共有的不足是检测灵敏度不高，无法准确测定超痕量糠醛类化合物的含量。为此，本实验结合最新科研成果，通过香豆素羟胺(HAHC，结构式见图1)中的化合物1与醛类分子的硝酮化反应，使醛类分子生成带有荧光基团的衍生物，随后基于高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)实现糠醛类化合物的定量分析。与其他方法相比，本方法选择性高，线性范围宽，检测限低，具有创新性和实用性。

在教学过程中，学生通过查阅文献，可以掌握分子结构与荧光的关系、硝酮化反应机理和色谱分离原理等相关理论知识；在实验过程中，不仅将溶液配制、分离、化学衍生方法以及常用仪器的基本操作有机结合在一起，还引入了实验条件优化、现代大型分析仪器使用和实验数据处理及分析等环节，使实验技能训练与科学研究方法相结合，有利于培养学生的综合实验能力和创新思维。为了培养学生协同工作的能力，实验以分组形式进行，每组3人，每次实验课有5组学生同时开展实验，实验教学时间在24 h以内。

实验中采用含有香豆素荧光团的N-取代羟胺，即HAHC，来对醛类分子进行荧光衍生。HAHC中含有的香豆素基团，具有体积小、荧光量子产率高、Stokes位移大等优点，可以作为优异的荧光报告基团^[6–8]。香豆素基团通过脂肪长链与N-取代羟胺相连，当羟胺与醛类分子发生硝酮化反应时，生成带有香豆素荧光基团的衍生物2 (图1)。衍生物2可以通过高效液相色谱-荧光检测进行定量分析，并通过高分辨质谱进行结构鉴定。实验中采用的硝酮化反应进行衍生避免了其他方法中常见的衍生物中同分异构体的存在对色谱图分析的影响，衍生产物中的长脂肪链对于色谱行为的改善和质谱信号的增强均有贡献。这进一步体现了本实验方法的创新性和实用性。

本实验所用试剂见表1，纯水由Milli-Q超纯水系统制备。

本实验所用主要仪器见表2。荧光衍生试剂的最大激发波长和最大发射波长在LS-55荧光光谱仪上测定，用于高效液相色谱仪荧光检测器的激发波长和发射波长的设置。荧光衍生物通过配有反相C18色谱柱的高效液相色谱仪来分离和定量分析，含有衍生物的馏分进一步通过高分辨质谱来确证其分子结构。

配制10 mmol∙L⁻¹ HAHC的甲醇溶液；分别配制0.01 mmol∙L⁻¹的F、5-MF和5-HMF的甲醇溶液；配制0.1 mmol∙L⁻¹的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH = 3.5)；配制20 mmol∙L⁻¹苯胺的甲醇溶液。

一个标准衍生过程的操作如下：将20 μL衍生试剂HAHC溶液(1 mmol∙L⁻¹)、10 μL醛溶液(0.01 mmol∙L⁻¹)、10 μL苯胺溶液和10 μL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.1 mol∙L⁻¹，pH = 3.5)混合于1.5 mL的离心管中，在漩涡混合器上充分振荡混合均匀。混合溶液置于20 ℃的恒温水浴锅中反应30 min，随后20 μL的混合物样品被直接注射到色谱系统中进行分析。其他不同浓度的醛的衍生过程与标准衍生过程类似。衍生试剂的空白色谱分析与标准衍生过程的区别是没有加入醛溶液，而是另外加入10 μL甲醇。

用乙腈/水(1.0/9.0，V/V)配制2 μmol∙L⁻¹衍生试剂HAHC的溶液，在紫外可见分光光度计UV-1240上扫描得到其最大吸收波长。LS-55荧光光谱仪设置最大吸收波长为激发波长，在350至600 nm范围内扫描其发射光谱，确定其最大发射波长。然后将发射波长设置为最大发射波长，在200至400 nm范围扫描其激发波长，从而得到最大激发波长。得到的最大激发波长和最大发射波长分别为322和447 nm。

样品的色谱分析在HPLC上进行，通过一个反相C18柱实现各组分的分离。流动相均用砂芯过滤装置过滤(滤膜孔径为0.22 μm)，然后超声30 min备用。流动相的流速设定为1 mL∙min⁻¹，荧光检测器的激发波长和发射波长分别设定为322和447 nm。在样品分析前，色谱柱先用流动相平衡30 min。20 μL前期得到的试样被注射到色谱系统中进行分析。色谱柱的柱温保持为30 ℃，当采用二元梯度淋洗程序进行分离时，流动相A为乙腈-水(0.5/9.5，V/V)，流动相B为乙腈，梯度设置：0–12 min，13% B；12–20 min，20% B。一些色谱分析也采用了等浓度洗脱方式。

衍生物经色谱分离的馏分通过高分辨质谱Q Exactive Plus进行分析。采用纳升电喷雾离子源(Nano-ESI)，喷针电压为2.25 kV，以阳离子扫描的方式扫描，m/z在50–750的范围。得到的结果用于确认各种醛类分子荧光衍生物的生成。

荧光定量分析的回归方程通过以下方法获得：选取浓度范围从定量限(LOQ)到4 μmol∙L⁻¹的糠醛样品用于荧光衍生，然后线性拟合荧光衍生物所对应的色谱峰的面积和相应的浓度得到回归方程和对应的相关系数。加标回收率的测定方法是在样品准备过程之前加入中等浓度或高浓度的同种糠醛的溶液(0.4和1 μmol∙L⁻¹)，然后通过下面的方程计算回收率：

回收率= C_recovered/C_spiked × 100%

其中C_recovered是使用本方法通过回归方程计算得到糠醛类物质的浓度，C_spiked是实际加入的糠醛类物质的浓度。

为了定量分析奶粉中糠醛类物质的浓度，需要对奶粉样品进行前处理。方法如下：准确称取5.0 g奶粉样品(内蒙古蒙牛乳液股份有限公司)于50 mL离心管中，加入25 mL温度为30 ℃的水溶解奶粉，超声振荡10 min。加入1 mL 25%乙酸溶液用来沉淀蛋白，再加入甲醇定容到50 mL，混匀后采用截留分子量为5 kDa的超滤离心管离心，取滤出液经0.22 μm滤膜过滤，待衍生分析。

HAHC是一种我们制备的新型荧光衍生试剂。经荧光光谱测定，其荧光激发光谱和发射光谱如图2所示，由此确定最大激发波长和最大发射波长分别为322和447 nm。首先尝试糠醛与HAHC的衍生反应来验证方法的可行性。反应在50 ℃进行1 h后通过HPLC-FLD进行分析，保留时间为10 min处出现的新峰对应的是糠醛的荧光衍生物F-HAHC(图3A)。该馏分被收集后用高分辨质谱进行分析(图3B)，质谱中m/z = 328.12的离子峰对应的是F-HAHC的加氢峰(m/z = 328.1182)，进一步证实了糠醛成功地被HAHC衍生。质谱的信号很强，表明经HAHC是一个可以产生良好的质谱响应的衍生试剂。色谱流出曲线中只有一个单一的确定的衍生峰，避免了醛的其他衍生方法中经常出现的多个衍生产物的情况发生。这不仅简化了色谱图，也方便了多种糠醛类化合物的混合物的定量分析。

醛类分子与HAHC分子的衍生效率受到反应时间、反应温度、pH、衍生试剂的用量以及催化剂有关。我们用衍生产物在色谱图上的峰面积来估算衍生效率，峰面积越大，衍生效率越高。最终通过实验我们确定了当苯胺作为催化剂时的最佳衍生条件：pH = 3.5，HAHC的浓度为0.4 nmol∙L⁻¹，苯胺的浓度为4 mmol∙L⁻¹，最佳反应温度20 ℃。

在前期得到的最优的衍生条件下，将F、5-HMF、5-MF等摩尔比混合与HAHC衍生反应。采用实验部分所述的梯度洗脱程序对衍生产物进行液相色谱分离，使用乙腈-水体系作为流动相。具体洗脱程序见实验部分2.4.4。如图4所示，三种糠醛衍生后的色谱图比衍生前多出三个明显的色谱峰，5-HMF、F和5-MF衍生产物的出峰时间依次为9.4、19.8和25.1 min。为了确定三种糠醛的衍生产物，我们分别对其进行了LC-MS检测，质谱结果进一步证实了正确衍生产物的生成。这表明可以采用HAHC同时对三种糠醛进行检测和定量分析。

在优化条件下，不同浓度的三种糠醛的标准混合物通过新的衍生方法进行了分析。详细的描述见实验部分2.4.6。本分析方法的线性范围、回归方程、相关系数(R²)和检测限如表3所示。由表可知，以三种糠醛定量限(LOQ，S/N = 10)的浓度到4000 nmol∙L⁻¹为线性范围，在此范围内具有较好的线性关系，相关系数R²在0.9991到0.9998之间；检测限(LOD，S/N = 3)为0.1 nmol∙L⁻¹到0.8 nmol∙L⁻¹，可以满足食品中糠醛类化合物含量的检测。结果表明，此衍生方法能够对糠醛物质进行高灵敏度、高选择性、高精密度的分析检测。

在新鲜的食品中不存在糠醛，但是可以在各种热处理的食品中发现它们，例如干果和乳制品。因此，实验中选用奶粉测定其中5-HMF、F和5-MF的含量。奶粉经过实验步骤2.4.7处理后，采用标准方法进行各种糠醛含量的测定。实际样品的加标回收率实验是通过在奶粉样品中分别加入中等和高等浓度(0.40和1.00 μmol∙L⁻¹)的混合糠醛标准溶液，按相同实验方法处理后进样，每个样品平行测定六次。图5展示了奶粉样品和在其中加入混合糠醛的标准溶液后得到的色谱图，从图中可以看出奶粉中存在F和5-HMF。经计算(表4)，F和5-HMF平均含量分别为0.84和11.35 mg∙kg⁻¹，其中5-HMF的含量相对较高。为了保证食品安全，需要对5-HMF的含量进行严格监控。在奶粉中没有检测到5-MF，这与其他关于奶粉样品分析的研究结果一致。

“综合化学实验”课程是我校应用化学专业所开设的一门重要实验课，在培养学生的综合能力和素质方面具有重要的作用。该课程要求紧密结合现代合成和分析新技术和新理论，及时更新实验项目，为此我们将香豆素羟胺在糠醛类化合物的荧光检测中的相关科研成果进行重新设计，反复验证，形成了“香豆素羟胺在糠醛类化合物荧光定量分析中的应用”这项可以在24 h以内完成的综合实验。本实验综合了有机化学、物理化学、分析化学以及仪器分析等实验的原理和操作方法，结合了实验教学和科学研究的特点。在内容设计上充分考虑调动学生的主动性、积极性和创造性，使学生在了解荧光与分子结构的关系、荧光衍生试剂的设计与选择、现代分析仪器的检测原理及应用范围的基础上，通过对仪器测试条件的选择、衍生反应条件的优化和定量分析，掌握准确测定奶粉中糠醛类化合物含量的方法，从而达到激发学生对科学研究的兴趣、提高学生的动手操作能力、培养其勤于思考的科学精神和全面提升其创新能力和综合素质的目的。

(1)实验方法具有选择性好、线性范围宽、检测限低等优点；

(2)实验方法具有拓宽性，可扩展为其他醛类化合物检测；

(3)实验方法具有延展性和实用性，可延伸为大学生创新创业实践项目。