大学化学, 2020, 35(4): 145-151 doi: 10.3866/PKU.DXHX201912013

 

香豆素羟胺在糠醛类化合物荧光定量分析中的应用

林亚维, 谭俊杰, 许颖, 姚文高, 胡晓松,

Application of Coumarin Hydroxylamine in the Fluorescent Quantitative Analysis of Furfural Molecules

Lin Yawei, Tan Junjie, Xu Ying, Yao Wengao, Hu Xiaosong,

通讯作者: 胡晓松, Email: xhu@whut.edu.cn

收稿日期: 2019-12-2   接受日期: 2019-12-20  

Received: 2019-12-2   Accepted: 2019-12-20  

摘要

糠醛类化合物在食品工业中是一种独特的风味物质,但在人体积蓄过多时具有一定的致癌作用,因此在食品工业和环境检测中糠醛类化合物的定量分析十分重要。本实验以香豆素羟胺作为荧光标记物,通过硝酮化反应对糠醛类化合物进行荧光衍生,并结合液相色谱-荧光检测法准确测定了奶粉中糠醛、5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛的含量,具有选择性高、线性范围宽、检测限低等优点。本实验将最新的科学研究成果转换为应用化学专业“综合化学实验”课程中的一个研究设计性实验,力图通过全方位的实验操作和训练,使学生充分了解荧光与分子结构的关系、荧光衍生试剂的设计与选择、现代分析仪器的检测原理及应用范围;通过对仪器测试条件和衍生反应条件进行优化,学会实验设计的优化方法,了解科学研究的基本流程,从而激发学生对科学研究的兴趣,提高学生的动手操作能力,培养其勤于思考的科学精神,全面提升其创新能力和综合素质。

关键词: 糠醛类化合物 ; 香豆素羟胺 ; 硝酮化反应 ; 液相色谱 ; 荧光定量分析

Abstract

Furfural compounds are unique flavor substances in the food industry, but they have a certain carcinogenic effect when accumulated in human body. Therefore, quantitative analysis of furfural compounds is very important in food industry and environmental detection. In this experiment, coumarin hydroxylamine was used as fluorescent label to derive furfural compounds by nitronization reaction, and the contents of furfural, 5-methyl furfural and 5-hydroxymethyl furfural in milk powder were accurately determined by liquid chromatography-fluorescence detection. The method has the advantages of high selectivity, wide linear range and low detection limit. This innovative experiment is based on the latest research results, and is developed into a research design experiment in "comprehensive chemistry laboratory" course of applied chemistry major. Through all-round experimental operation and training, students can fully understand the relationship between fluorescence and molecular structure, the design and selection of fluorescent derivative reagents, the detection principle and application of modern analytical instruments. By optimizing the test conditions and derivative reaction conditions of the instrument, students can learn how to optimize the experimental design and understand the basic process of scientific research. Thus, it can stimulate students' interest in scientific research, improve their operational ability, cultivate their scientific spirit of diligent thinking, and enhance their innovative ability and comprehensive quality.

Keywords: Furfural compounds ; Coumarin hydroxylamine ; Nitronization reaction ; Liquid chromatography ; Fluorescence quantitative analysis

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林亚维, 谭俊杰, 许颖, 姚文高, 胡晓松. 香豆素羟胺在糠醛类化合物荧光定量分析中的应用. 大学化学[J], 2020, 35(4): 145-151 doi:10.3866/PKU.DXHX201912013

Lin Yawei. Application of Coumarin Hydroxylamine in the Fluorescent Quantitative Analysis of Furfural Molecules. University Chemistry[J], 2020, 35(4): 145-151 doi:10.3866/PKU.DXHX201912013

1 引言

糠醛类化合物是由富含糖类的物质经热加工致使糖降解,或氨基酸、蛋白质与还原性糖发生美拉德反应产生的一类化合物,主要包括糠醛(F)、5-甲基糠醛(5-MF)和5-羟甲基糠醛(5-HMF)这三种化合物。当食品中糠醛类化合物的含量处于较低水平时,可以使食品产生令人愉悦的风味,但当其含量过高时,会导致食品变质,从而影响食品的新鲜度和食用者的身体健康,甚至导致食用者罹患癌症。因此,食品中的糠醛类物质的检测已经引起越来越多的关注,在消费者保护和食品质量控制方面显得极其重要[15]

目前,糠醛类化合物的检测方法包括分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱-紫外检测法等。上述方法共有的不足是检测灵敏度不高,无法准确测定超痕量糠醛类化合物的含量。为此,本实验结合最新科研成果,通过香豆素羟胺(HAHC,结构式见图1)中的化合物1与醛类分子的硝酮化反应,使醛类分子生成带有荧光基团的衍生物,随后基于高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)实现糠醛类化合物的定量分析。与其他方法相比,本方法选择性高,线性范围宽,检测限低,具有创新性和实用性。

图1

图1   香豆素羟胺和醛类分子的硝酮化衍生反应


在教学过程中,学生通过查阅文献,可以掌握分子结构与荧光的关系、硝酮化反应机理和色谱分离原理等相关理论知识;在实验过程中,不仅将溶液配制、分离、化学衍生方法以及常用仪器的基本操作有机结合在一起,还引入了实验条件优化、现代大型分析仪器使用和实验数据处理及分析等环节,使实验技能训练与科学研究方法相结合,有利于培养学生的综合实验能力和创新思维。为了培养学生协同工作的能力,实验以分组形式进行,每组3人,每次实验课有5组学生同时开展实验,实验教学时间在24 h以内。

2 实验部分

2.1 实验原理

实验中采用含有香豆素荧光团的N-取代羟胺,即HAHC,来对醛类分子进行荧光衍生。HAHC中含有的香豆素基团,具有体积小、荧光量子产率高、Stokes位移大等优点,可以作为优异的荧光报告基团[68]。香豆素基团通过脂肪长链与N-取代羟胺相连,当羟胺与醛类分子发生硝酮化反应时,生成带有香豆素荧光基团的衍生物2 (图1)。衍生物2可以通过高效液相色谱-荧光检测进行定量分析,并通过高分辨质谱进行结构鉴定。实验中采用的硝酮化反应进行衍生避免了其他方法中常见的衍生物中同分异构体的存在对色谱图分析的影响,衍生产物中的长脂肪链对于色谱行为的改善和质谱信号的增强均有贡献。这进一步体现了本实验方法的创新性和实用性。

2.2 试剂或材料

本实验所用试剂见表1,纯水由Milli-Q超纯水系统制备。

表1   主要实验试剂或材料

试剂名称分子式CAS号规格纯度制造商
HAHCC13H15NO4实验室自制
糠醛C5H4O298-01-1AR99%百灵威科技有限公司
5-甲基糠醛C6H6O2620-02-0AR99%百灵威科技有限公司
5-羟甲基糠醛C6H6O367-47-0AR99%百灵威科技有限公司
冰乙酸C2H4O264-19-7AR99.5%上海凌峰化学试剂有限公司
乙酸钠C2H3O2Na6505-45-9AR99.5%上海凌峰化学试剂有限公司
苯胺C6H7N62-53-3AR99.5%上海凌峰化学试剂有限公司
乙腈C2H3N75-05-8HPLC99.9%FisherScientific公司
甲醇CH4O67-56-1HPLC99.9%FisherScientific公司

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2.3 仪器和表征方法

本实验所用主要仪器见表2。荧光衍生试剂的最大激发波长和最大发射波长在LS-55荧光光谱仪上测定,用于高效液相色谱仪荧光检测器的激发波长和发射波长的设置。荧光衍生物通过配有反相C18色谱柱的高效液相色谱仪来分离和定量分析,含有衍生物的馏分进一步通过高分辨质谱来确证其分子结构。

表2   主要实验仪器

仪器名称型号制造商
高效液相色谱仪LC-20A岛津公司
荧光光谱仪LS-55珀金埃尔默公司
荧光检测器RF-20A岛津公司
紫外检测器SPD-20A岛津公司
紫外-可见分光光度计UV-1240岛津公司
质谱仪QExactivePlus赛默飞世尔公司
电子天平Mettler-ToledoAL104梅特勒-托利多公司
恒温水浴锅HH-1国华电器有限公司
漩涡混合器HQ-60-Ⅱ上海沪西分析仪器厂
pH酸度计PXSJ-216F上海仪电科学仪器股份有限公司
高速常温离心机5415D艾本德公司

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2.4 实验步骤/方法

2.4.1 溶液的配制

配制10 mmol∙L−1 HAHC的甲醇溶液;分别配制0.01 mmol∙L−1的F、5-MF和5-HMF的甲醇溶液;配制0.1 mmol∙L−1的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH = 3.5);配制20 mmol∙L−1苯胺的甲醇溶液。

2.4.2 标准品衍生化

一个标准衍生过程的操作如下:将20 μL衍生试剂HAHC溶液(1 mmol∙L−1)、10 μL醛溶液(0.01 mmol∙L−1)、10 μL苯胺溶液和10 μL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.1 mol∙L−1,pH = 3.5)混合于1.5 mL的离心管中,在漩涡混合器上充分振荡混合均匀。混合溶液置于20 ℃的恒温水浴锅中反应30 min,随后20 μL的混合物样品被直接注射到色谱系统中进行分析。其他不同浓度的醛的衍生过程与标准衍生过程类似。衍生试剂的空白色谱分析与标准衍生过程的区别是没有加入醛溶液,而是另外加入10 μL甲醇。

2.4.3 荧光分析

用乙腈/水(1.0/9.0,V/V)配制2 μmol∙L−1衍生试剂HAHC的溶液,在紫外可见分光光度计UV-1240上扫描得到其最大吸收波长。LS-55荧光光谱仪设置最大吸收波长为激发波长,在350至600 nm范围内扫描其发射光谱,确定其最大发射波长。然后将发射波长设置为最大发射波长,在200至400 nm范围扫描其激发波长,从而得到最大激发波长。得到的最大激发波长和最大发射波长分别为322和447 nm。

2.4.4 色谱分析

样品的色谱分析在HPLC上进行,通过一个反相C18柱实现各组分的分离。流动相均用砂芯过滤装置过滤(滤膜孔径为0.22 μm),然后超声30 min备用。流动相的流速设定为1 mL∙min−1,荧光检测器的激发波长和发射波长分别设定为322和447 nm。在样品分析前,色谱柱先用流动相平衡30 min。20 μL前期得到的试样被注射到色谱系统中进行分析。色谱柱的柱温保持为30 ℃,当采用二元梯度淋洗程序进行分离时,流动相A为乙腈-水(0.5/9.5,V/V),流动相B为乙腈,梯度设置:0–12 min,13% B;12–20 min,20% B。一些色谱分析也采用了等浓度洗脱方式。

2.4.5 质谱分析

衍生物经色谱分离的馏分通过高分辨质谱Q Exactive Plus进行分析。采用纳升电喷雾离子源(Nano-ESI),喷针电压为2.25 kV,以阳离子扫描的方式扫描,m/z在50–750的范围。得到的结果用于确认各种醛类分子荧光衍生物的生成。

2.4.6 方法验证

荧光定量分析的回归方程通过以下方法获得:选取浓度范围从定量限(LOQ)到4 μmol∙L−1的糠醛样品用于荧光衍生,然后线性拟合荧光衍生物所对应的色谱峰的面积和相应的浓度得到回归方程和对应的相关系数。加标回收率的测定方法是在样品准备过程之前加入中等浓度或高浓度的同种糠醛的溶液(0.4和1 μmol∙L−1),然后通过下面的方程计算回收率:

回收率= Crecovered/Cspiked × 100%

其中Crecovered是使用本方法通过回归方程计算得到糠醛类物质的浓度,Cspiked是实际加入的糠醛类物质的浓度。

2.4.7 奶粉样品的前处理

为了定量分析奶粉中糠醛类物质的浓度,需要对奶粉样品进行前处理。方法如下:准确称取5.0 g奶粉样品(内蒙古蒙牛乳液股份有限公司)于50 mL离心管中,加入25 mL温度为30 ℃的水溶解奶粉,超声振荡10 min。加入1 mL 25%乙酸溶液用来沉淀蛋白,再加入甲醇定容到50 mL,混匀后采用截留分子量为5 kDa的超滤离心管离心,取滤出液经0.22 μm滤膜过滤,待衍生分析。

3 结果与讨论

3.1 糠醛类化合物和HAHC的衍生反应

HAHC是一种我们制备的新型荧光衍生试剂。经荧光光谱测定,其荧光激发光谱和发射光谱如图2所示,由此确定最大激发波长和最大发射波长分别为322和447 nm。首先尝试糠醛与HAHC的衍生反应来验证方法的可行性。反应在50 ℃进行1 h后通过HPLC-FLD进行分析,保留时间为10 min处出现的新峰对应的是糠醛的荧光衍生物F-HAHC(图3A)。该馏分被收集后用高分辨质谱进行分析(图3B),质谱中m/z = 328.12的离子峰对应的是F-HAHC的加氢峰(m/z = 328.1182),进一步证实了糠醛成功地被HAHC衍生。质谱的信号很强,表明经HAHC是一个可以产生良好的质谱响应的衍生试剂。色谱流出曲线中只有一个单一的确定的衍生峰,避免了醛的其他衍生方法中经常出现的多个衍生产物的情况发生。这不仅简化了色谱图,也方便了多种糠醛类化合物的混合物的定量分析。

图2

图2   荧光衍生试剂HAHC的荧光激发和荧光发射光谱


图3

图3   糠醛(F)和HAHC的荧光衍生结果

(A)典型的糠醛衍生产物F-HAHC的色谱图;色谱分离采用等浓度洗脱方式,流动为乙腈-水(3.0/7.0, V/V);流速:1.0 mL∙min−1;(B) F-HAHC的高分辨质谱图


3.2 衍生条件的优化

醛类分子与HAHC分子的衍生效率受到反应时间、反应温度、pH、衍生试剂的用量以及催化剂有关。我们用衍生产物在色谱图上的峰面积来估算衍生效率,峰面积越大,衍生效率越高。最终通过实验我们确定了当苯胺作为催化剂时的最佳衍生条件:pH = 3.5,HAHC的浓度为0.4 nmol∙L−1,苯胺的浓度为4 mmol∙L−1,最佳反应温度20 ℃。

3.3 混合糠醛的分离与检测

在前期得到的最优的衍生条件下,将F、5-HMF、5-MF等摩尔比混合与HAHC衍生反应。采用实验部分所述的梯度洗脱程序对衍生产物进行液相色谱分离,使用乙腈-水体系作为流动相。具体洗脱程序见实验部分2.4.4。如图4所示,三种糠醛衍生后的色谱图比衍生前多出三个明显的色谱峰,5-HMF、F和5-MF衍生产物的出峰时间依次为9.4、19.8和25.1 min。为了确定三种糠醛的衍生产物,我们分别对其进行了LC-MS检测,质谱结果进一步证实了正确衍生产物的生成。这表明可以采用HAHC同时对三种糠醛进行检测和定量分析。

图4

图4   混合糠醛标准溶液与HAHC

(A)衍生前;(B)衍生后色谱图对比


3.4 方法学验证

在优化条件下,不同浓度的三种糠醛的标准混合物通过新的衍生方法进行了分析。详细的描述见实验部分2.4.6。本分析方法的线性范围、回归方程、相关系数(R2)和检测限如表3所示。由表可知,以三种糠醛定量限(LOQ,S/N = 10)的浓度到4000 nmol∙L−1为线性范围,在此范围内具有较好的线性关系,相关系数R2在0.9991到0.9998之间;检测限(LOD,S/N = 3)为0.1 nmol∙L−1到0.8 nmol∙L−1,可以满足食品中糠醛类化合物含量的检测。结果表明,此衍生方法能够对糠醛物质进行高灵敏度、高选择性、高精密度的分析检测。

表3   检测方法的线性范围、回归方程、相关系数和检测限

糠醛线性范围/(nmol∙L−1)回归方程a(Y = AX + B)R2检测限b/(nmol∙L−1)
5-HMF2–4000Y = 1.99X − 1.93 × 1040.99910.8
F0.8–4000Y = 1.78X + 3.45 × 1040.99980.2
5-MF0.4–4000Y = 1.58X + 1.31 × 1050.99950.1

aX =样品浓度(pmol∙L−1);Y =峰面积(mV∙min−1);bS/N = 3

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3.5 奶粉中糠醛含量的分析

在新鲜的食品中不存在糠醛,但是可以在各种热处理的食品中发现它们,例如干果和乳制品。因此,实验中选用奶粉测定其中5-HMF、F和5-MF的含量。奶粉经过实验步骤2.4.7处理后,采用标准方法进行各种糠醛含量的测定。实际样品的加标回收率实验是通过在奶粉样品中分别加入中等和高等浓度(0.40和1.00 μmol∙L−1)的混合糠醛标准溶液,按相同实验方法处理后进样,每个样品平行测定六次。图5展示了奶粉样品和在其中加入混合糠醛的标准溶液后得到的色谱图,从图中可以看出奶粉中存在F和5-HMF。经计算(表4),F和5-HMF平均含量分别为0.84和11.35 mg∙kg−1,其中5-HMF的含量相对较高。为了保证食品安全,需要对5-HMF的含量进行严格监控。在奶粉中没有检测到5-MF,这与其他关于奶粉样品分析的研究结果一致。

图5

图5   奶粉样品(A)和奶粉样品加标5-HMF和F (均为1.0 μmol∙L−1) (B)的色谱图

◆ = 5-HMF-HAHC;* = F-HAHC


表4   奶粉样品中糠醛类化合物含量的测定

样品奶粉样品
加标量/(μmol∙L−1)回收量/(μmol∙L−1)回收率/% a含量b
5-HMF0.001.44/11.35 ± 0.31
0.401.8397.5 ± 2.0
1.002.4197.0 ± 2.7
F0.000.14/0.84 ± 0.03
0.400.5397.5 ± 2.4
1.001.1298.0 ± 3.1

a平均值±标准偏差(n = 6, %);b平均值±标准偏差(n = 6, mg∙kg−1)

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4 结语

“综合化学实验”课程是我校应用化学专业所开设的一门重要实验课,在培养学生的综合能力和素质方面具有重要的作用。该课程要求紧密结合现代合成和分析新技术和新理论,及时更新实验项目,为此我们将香豆素羟胺在糠醛类化合物的荧光检测中的相关科研成果进行重新设计,反复验证,形成了“香豆素羟胺在糠醛类化合物荧光定量分析中的应用”这项可以在24 h以内完成的综合实验。本实验综合了有机化学、物理化学、分析化学以及仪器分析等实验的原理和操作方法,结合了实验教学和科学研究的特点。在内容设计上充分考虑调动学生的主动性、积极性和创造性,使学生在了解荧光与分子结构的关系、荧光衍生试剂的设计与选择、现代分析仪器的检测原理及应用范围的基础上,通过对仪器测试条件的选择、衍生反应条件的优化和定量分析,掌握准确测定奶粉中糠醛类化合物含量的方法,从而达到激发学生对科学研究的兴趣、提高学生的动手操作能力、培养其勤于思考的科学精神和全面提升其创新能力和综合素质的目的。

5 创新性/特点/特色声明

(1)实验方法具有选择性好、线性范围宽、检测限低等优点;

(2)实验方法具有拓宽性,可扩展为其他醛类化合物检测;

(3)实验方法具有延展性和实用性,可延伸为大学生创新创业实践项目。

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