大学化学, 2020, 35(4): 173-177 doi: 10.3866/PKU.DXHX201912004

 

基于氢键作用的金纳米粒子比色法检测尿酸

鲁立强,, 王晗, 曹怀元, 郄浩飞, 王明涛, 李勇, 田熙科

Determination of Uric Acid by Gold Nanoparticles Colorimetry Based on Hydrogen Bonding

Lu Liqiang,, Wang Han, Cao Huaiyuan, Qie Haofei, Wang Mingtao, Li Yong, Tian Xike

通讯作者: 鲁立强,Email: llqdick@163.com

收稿日期: 2019-12-2   接受日期: 2019-12-16  

基金资助: 中国地质大学(武汉)本科教学改革研究项目

Received: 2019-12-2   Accepted: 2019-12-16  

摘要

尿酸含量高可使人产生痛风等疾病,尿酸的测定是临床检测重要的生化指标之一。金纳米粒子比色法检测尿酸实验联系实际生活,将科研前沿和教学内容有机结合起来,可以激发学生的学习兴趣,加深学生对经典理论的理解,增加学生对科研前沿的了解。本实验利用金纳米粒子吸光系数高的特点,通过尿酸与三聚氰胺反应后,抑制三聚氰胺诱导的金纳米粒子聚集,从而达到检测尿酸的目的。随着溶液中尿酸浓度的增加,溶液颜色由蓝变红,差别明显,视觉效果好,容易分辨。

关键词: 金纳米粒子 ; 尿酸 ; 三聚氰胺 ; 比色法

Abstract

High content of uric acid can cause gout and other diseases, and thus uric acid is one of the important biochemical indicators in clinical test. Detection of uric acid based on gold nanoparticle colorimetry combines the forefront of scientific research with the content of teaching, which can stimulate students' interest in learning, deepen their understanding of classical theories and increase their understanding of the forefront of scientific research. In this experiment, gold nanoparticles were used to detect uric acid by inhibiting the accumulation of gold nanoparticles induced by melamine after the reaction of uric acid with melamine. With the increase of the concentration of uric acid in the solution, the color of the solution changes from blue to red, and the difference is obvious. The visual effect is good and easy to observe.

Keywords: Gold nanoparticles ; Uric acid ; Melamine ; Colorimetry

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鲁立强, 王晗, 曹怀元, 郄浩飞, 王明涛, 李勇, 田熙科. 基于氢键作用的金纳米粒子比色法检测尿酸. 大学化学[J], 2020, 35(4): 173-177 doi:10.3866/PKU.DXHX201912004

Lu Liqiang. Determination of Uric Acid by Gold Nanoparticles Colorimetry Based on Hydrogen Bonding. University Chemistry[J], 2020, 35(4): 173-177 doi:10.3866/PKU.DXHX201912004

比色法根据吸光物质的浓度与溶液颜色之间的关系来测定待测组分的含量,方法简便、快速,肉眼即可观察溶液颜色的变化,无需大型仪器设备,受到人们的普遍关注。金纳米粒子比色法(gold nanoparticle colorimetry)是近年来新发展起来的一种比色分析方法,其利用金纳米粒子因表面等离子体共振效应而具有高吸光系数的特点,可以实现高灵敏度的检测。将金纳米粒子比色法加入到本科教学实验中,可以将科研前沿和教材内容有机结合,充分激发学生的学习兴趣,加深学生对经典理论的理解,增加学生对科研前沿的了解。

生物分子尿酸(uric acid),即2, 4, 6-三羟基嘌呤,是一种有机弱酸,不溶于水,也难溶于酸、醚和乙醇。它是人体嘌呤代谢的最终产物,能清除细胞中的氧自由基,具有抗氧化的作用。尿酸由体内代谢的嘌呤在肝脏中氧化而成,再经肾脏随尿液排出,因此,尿酸含量的变化,可以充分反映人体内代谢、免疫等机能的状况。人类在健康的生理状态下尿酸含量相对稳定,但在病理状态下,其含量会发生波动。尿酸水平的异常会引起痛风、高尿酸血症等与嘌呤代谢有关的疾病。近年来,研究发现了一些与尿酸结石、尿酸代谢酶相关的罕见遗传性疾病;同时还发现尿酸是引发多因素肾疾病如慢性肾脏病(CKD)、高血压和急性肾损伤(AKI)的一个关键因素[1]。因此,尿酸的测定是临床检测的重要生化指标之一,对临床疾病的诊断具有重要的意义。

目前已有很多方法用于尿酸的检测,大多数是基于尿酸氧化酶的作用,如紫外-可见分析系统酶偶联法在线检测尿酸[2]、尿酸酶生物传感器[3]、金电极修饰的自组装单层杂环原子硫醇伏安检测法[4]、电还原氧化石墨烯修饰电极等的电化学检测方法[5]、CdTe量子点荧光检测尿酸[6, 7]、基于二硫苏糖醇修饰的尿酸酶传感器流动注射检测尿酸[8],以及高效液相色谱法[9]等。这些利用尿酸酶的方法虽然具有较高的选择性,但是酶的价格昂贵,还需要加入使酶失活的抑制剂,且分析前均需要一段酶反应时间,导致步骤繁琐、操作时间长、条件难以控制。而比色法简便、快速,肉眼即可观察溶液颜色的变化,无需大型仪器设备,受到人们的普遍关注。

本实验运用基于氢键作用的金纳米粒子比色法检测尿酸。三聚氰胺具有3个环外氨基和3个杂环氮原子,使其具有多个富含电子的结合位点,可以很强地吸附在金纳米粒子表面;吸附在金纳米粒子表面的三聚氰胺通过自身分子间氢键作用交联,使金纳米粒子发生团聚。同时,三聚氰胺中的二酰亚胺结构可以和尿酸中的二氨基吡啶结构通过NH…N、NH…O的氢键,形成稳定的配合物而结合起来[10]。当一定量的三聚氰胺先与尿酸反应后,再与金纳米粒子混合,随着尿酸浓度的增加,将消耗更多的三聚氰胺,溶液中剩余的三聚氰胺量减少,则金纳米粒子的聚集程度就会相应减弱,溶液由蓝色逐渐变为红色,吸光度也跟着改变,从而间接地检测尿酸的含量。

1 实验原理

基于氢键作用的金纳米粒子比色法检测尿酸的原理如图1所示。三聚氰胺中的二酰亚胺结构可以和尿酸中的二氨基吡啶结构通过NH…N、NH…O的氢键,形成稳定的配合物而结合起来(图1A)。同时,三聚氰胺的3个环外氨基和3个杂环氮原子,使其具有多个富含电子的结合位点,可以很强地吸附在金纳米粒子表面;吸附在金纳米粒子表面的三聚氰胺通过自身分子间氢键作用交联,使金纳米粒子发生团聚(图1B)。当一定量的三聚氰胺先与尿酸反应后,再与金纳米粒子混合时,随着尿酸浓度的增加,消耗了更多的三聚氰胺,溶液中剩余的三聚氰胺量减少,则金纳米粒子的聚集程度就会相应减弱,溶液由蓝色逐渐变为红色,其吸收曲线和相应的吸光度也跟着改变。

图1

图1   基于氢键作用的金纳米粒子比色法检测尿酸的原理示意图

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2 仪器与试剂

仪器:数显智能控温磁力搅拌器、SHA-C数显水浴恒温振荡器、紫外-可见分光光度计、pH计、超声清洗仪、100 mL容量瓶、50 mL烧杯、100 mL烧杯、100 μL移液管、10 mL比色管、100 mL锥形瓶、1 mL移液管。

试剂:氯金酸溶液(25 mmol∙L−1):准确称取0.2574 g氯金酸(HAuCl4∙4H2O) (上海化学试剂有限公司,分析纯)置于烧杯中,加超纯水溶解后,在25 mL容量瓶中定容并摇匀,放入4 ℃冰箱中保存备用。

尿酸溶液(1 mmol∙L−1):准确称取0.0168 g尿酸(Sigma Aldrich公司,分析纯)置于洁净的烧杯中,用6 mol∙L−1 NaOH使其溶解,再滴加盐酸调节pH至中性,最后用0.01 mol∙L−1 pH = 7.0的乙酸缓冲溶液在100 mL容量瓶中定容至刻线,放入4 ℃冰箱中保存。使用时移取不同体积稀释至所需浓度。

三聚氰胺溶液(1 mmol∙L−1):准确称取0.0126 g三聚氰胺(国药集团化学试剂有限公司,分析纯)置于洁净的烧杯中,加超纯水溶解后,在100 mL容量瓶中定容并摇匀,使用时稀释至所需浓度,此试剂使用一周左右后需重新配制。

所用溶液均用超纯水(Milli-Q,18.2 MΩ∙cm)配制。所有玻璃仪器均用新配制的王水[HCl/HNO3,3 : 1 (V/V)]浸泡24 h,再用超纯水清洗彻底后,干燥备用。

3 实验步骤

3.1 金纳米粒子的制备

金纳米粒子根据经典Frens柠檬酸钠还原氯金酸法制备而成。在100 mL锥形瓶中先后加入35 mL超纯水和0.5 mL 25 mmol∙L−1 HAuCl4溶液,混匀后置于电炉上加热,溶液沸腾后,迅速加入一定体积的38.8 mmol∙L−1柠檬酸钠溶液,摇匀,待溶液变色后,继续加热5 min再关闭电炉,取下溶液冷却至室温,最后放入4 ℃冰箱中保存备用。

3.2 尿酸的测定

取一只10 mL的洁净比色管,向其中加入1.0 mL 3.0 μmol∙L−1三聚氰胺溶液、1 mL pH = 7.0的0.01 mol∙L−1乙酸缓冲溶液、10–50 μL 10 μmol∙L−1尿酸溶液,摇匀,再加入1.0 mL上述制备的金纳米粒子溶液,并用超纯水定容至5 mL,摇匀,取溶液置入石英比色皿中,扫描其紫外-可见吸收光谱图。

4 结果与讨论

4.1 溶液pH的影响

根据文献资料可知,溶液中的pH会影响金纳米粒子与小分子之间的作用,且三聚氰胺呈弱碱性,pKa = 8.0,介质中的pH会影响三聚氰胺在溶液中的存在形式,因此首先对溶液的pH进行优化。用盐酸和氢氧化钠调节0.01 mol∙L−1乙酸-乙酸钠缓冲溶液,使体系pH范围在1.0–14.0变化,如图2所示。从图2可以看出,在强酸和强碱介质中(pH < 3.0和pH > 12.0),650和520 nm处的吸光度比值A650/A520很低;而在pH为7.0时,A650/A520出现最大值。在这里,A650/A520表示聚集态金纳米粒子的吸光度(A650)与分散态金纳米粒子的吸光度(A520)的比值,比值越大,聚集程度越高,反之则呈分散状态。在酸性介质中,三聚氰胺上的氨基质子化,在碱性介质中,三聚氰胺水解,都使三聚氰胺的分子间氢键作用减弱,而使金纳米粒子聚集程度减弱。因此,为获得更好的检测灵敏度,选择pH 7.0为适宜的实验条件,此时三聚氰胺的加入可使金纳米粒子聚集。

图2

图2   溶液pH对金纳米粒子溶胶吸光度比值的影响

黑线:存在三聚氰胺;红线:不存在三聚氰胺
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4.2 溶液中尿酸含量的检测

对溶液中不同浓度的尿酸进行测定,其裸眼可见的颜色变化如图3所示。随尿酸浓度的增加,依次为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 µmol∙L−1,溶液的颜色逐渐由蓝色变为蓝紫色、紫红色,最后变为红色,表明金纳米粒子在溶液中的存在状态逐渐由最初的聚集态呈现分散态,裸眼可见的最低浓度为0.2 µmol∙L−1。本方法作为准确定量测定前的初步判断,为快速测定提供了依据。

图3

图3   金纳米粒子在3.0 µmol∙L−1三聚氰胺和不同浓度尿酸溶液中的颜色变化

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对上述检测体系进行紫外-可见分光光度测试,以定量测定尿酸。如图4所示,当没有加入尿酸时,三聚氰胺使金纳米粒子聚集,吸收曲线上在600−750 nm范围内的吸收峰较强,而520 nm处的吸收峰较弱;随着尿酸浓度的增加,反应消耗更多的三聚氰胺,导致金纳米粒子聚集程度降低,520 nm的吸收峰逐渐增强,而在600–750 nm范围内的吸收峰减弱。

图4

图4   不同浓度尿酸检测体系的紫外-可见吸收光谱图

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5 结语

基于氢键作用的金纳米粒子比色法测定溶液尿酸的含量,利用尿酸与三聚氰胺分子间的氢键作用反应掉部分三聚氰胺,从而阻碍了由三聚氰胺诱导的金纳米粒子聚集,随着尿酸浓度的增加,溶液逐渐由蓝色变为红色。本实验的创新性在于不拘泥于传统的尿酸检测方法,利用金纳米粒子高吸光系数的特点,使反应前后的颜色变化显著,裸眼即可观察,且操作简便、快速。本实验将科研前沿和教材内容紧密结合,适合加入教学实验,供学生学习和探讨。

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