大学化学, 2020, 35(9): 76-82 doi: 10.3866/PKU.DXHX201908025

化学实验

论如何通过设计性实验提升学生的综合创新能力——以分光光度法同时测定维生素C和维生素E为例

王靖宇,1, 王蘅1, 熊辉1, 陈志飞1, 原弘2

Discussions on How to Improve the Comprehensive Innovation Abilities of Students by Designed Experiments: An Example of Simultaneous Determination of Vitamin C and E by Spectrophotometry

Wang Jingyu,1, Wang Heng1, Hui Xiong1, Chen Zhifei1, Yuan Hong2

通讯作者: 王靖宇, Email: wangjingyu@hust.edu.cn

收稿日期: 2019-08-17   接受日期: 2019-09-24  

基金资助: 中央高校基本科研业务费.  2018KFYYXJJ120
湖北高校省级教学研究项目.  2017095

Received: 2019-08-17   Accepted: 2019-09-24  

摘要

分光光度法同时测定维生素C和维生素E是一个典型的多组分同时测定实验,但是目前的测试体系对维生素C测定的误差较大(13.65%)。本文基于维生素C和维生素E的分子结构特征,剖析了影响维生素C测试准确度的原因,通过对测试体系进一步优化设计与改进,将测试误差降低至1.98%,实验证明改进后的方法准确度高、重现性好、结果更可靠。以此设计性实验为例,可多方面训练学生针对实际问题并结合理论知识优化实验设计方案,提高综合创新能力。

关键词: 同时测定 ; 维生素C ; 维生素E ; 分光光度法 ; 综合创新能力

Abstract

Simultaneous determination of vitamin C and vitamin E by spectrophotometry is a typical experiment of simultaneous determination of multiple components. However, the current experimental method has a large relative error (13.7%) in the determination of vitamin C. In this paper, according to the molecular structural characteristics of vitamin C and vitamin E, we studied the factors affecting the measurement accuracy of vitamin C and improve the experimental method by optimization pf design, and the error is reduced to 1.98%. Results proved that the improved method achieved higher accuracy, better reproducibility, more reliable results and better teaching responses. Through this designed experiment, the students are guided from many aspects such as aiming at practical problems and using theoretical knowledge to optimize the experimental scheme, therefore their comprehensive innovation abilities are improved.

Keywords: Simultaneous determination ; Vitamin C ; Vitamin E ; Spectrophotometry ; Comprehensive innovation ability

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王靖宇, 王蘅, 熊辉, 陈志飞, 原弘. 论如何通过设计性实验提升学生的综合创新能力——以分光光度法同时测定维生素C和维生素E为例. 大学化学[J], 2020, 35(9): 76-82 doi:10.3866/PKU.DXHX201908025

Wang Jingyu. Discussions on How to Improve the Comprehensive Innovation Abilities of Students by Designed Experiments: An Example of Simultaneous Determination of Vitamin C and E by Spectrophotometry. University Chemistry[J], 2020, 35(9): 76-82 doi:10.3866/PKU.DXHX201908025

在学生理解化学基本原理与掌握基本实验技能的基础上进一步开展设计性实验,不仅能够使学生将基础化学理论知识和各种实验技能相融合,还能培养学生提出问题、分析问题、解决问题的综合创新能力。在学生掌握单组分分析检测相关实验之后开展多组分同时测定的研究设计性实验尤为必要,这也是实际分析检测中经常面对的问题。但是,在多组分同时测定中往往多种目标物之间相互干扰,因此,如何避免繁琐的分离过程而实现多组分的一次性精确检测意义重大。维生素是维持人体正常生理功能的微量有机营养素。维生素C (又称抗坏血酸)是一种水溶性维生素,由于其抗氧化性,在预防感冒、白内障和心血管等疾病方面发挥着重要作用[1]。维生素E (亦称α-生育酚)是一种无毒的脂溶性抗氧化剂,有益于抗衰老,促进血液循环,减少患癌症的风险[2]。维生素C和维生素E结合在一起比单独使用的效果更佳,因为它们可表现出协同抗氧化作用,增强抗氧化能力[3]。因此,维生素C和维生素E的同时检测在制药和食品工业中受到广泛关注。

同时测定多组分含量的方法主要有分光光度法[4]、高效液相色谱法[5]和荧光分析法[6]等。其中,紫外-可见分光光度法广泛应用于微量定量分析,具有操作简单、分析快速、稳定性高、重复性好等优势[7]。分光光度法同时测定维生素C和维生素E是一个典型的多组分同时测定实验,也是第45届世界技能大赛“化学实验室技术”项目全国选拔赛试题,该实验根据维生素C和维生素E的光吸收互不影响且吸收光谱重叠程度小的特点,依据朗伯-比尔定律及吸光度的加和性原则,通过解联立方程组或双波长法可算出单一组分的含量[8]。由于维生素C是水溶性的,维生素E是脂溶性的,但是都能溶于无水乙醇,且彼此不发生化学反应,因此用无水乙醇作为溶剂,采用分光光度法在紫外光区进行同时测定。

维生素C分子中第2及第3位上两个相邻的烯醇式羟基极易解离而释出H+,故具有弱酸的性质。在酸性条件下,H+与烯醇氧原子上的孤对电子共轭形成氢键,有助于抑制维生素C解离,表现出的最大吸收波长在245 nm左右,溶液的pH升高到7.4时,维生素C的解离度增加易被氧化成脱氢维生素,此步反应可逆,最大吸收波长显著红移至268 nm左右,表明了酸度对维生素C稳定性的影响[9],如图1所示。然而,目前本实验的测试体系采用无水乙醇作为溶剂,乙醇羟基上的氧原子可以提供两对孤对电子与维生素C解离出的H+共轭形成氢键,导致pπ共轭结构被破坏,因此维生素C在无水乙醇溶液中稳定性较差,这一现象在低浓度维生素C的无水乙醇溶液中更为明显。实验发现,当维生素C的浓度降低至4.10 mg∙L−1时,结构的不稳定性导致测试结果误差可达13.65%。

图1

图1   pH对维生素C分子结构的影响


在前期试验中发现,当用95%工业乙醇替代无水乙醇作为溶剂时,由于工业乙醇中的酸性杂质有助于稳定维生素C的结构,使得测定结果更为准确。受此启发,我们对测试体系进行了优化设计与改进,通过引入微量硫酸(0.002 mol∙L−1)或醋酸(0.004 mol∙L−1)的酸性添加剂,有效抑制了维生素C的解离以增强其结构的稳定性,在浓度低于1.67 mg∙L−1时其最大吸收波长仍然稳定在245 nm处,绘制的标准曲线表现出较高的线性相关性(R2 > 0.999),对维生素C和维生素E的双组分体系的同时测定结果误差仅为1.98和0.89%。本校大学生实验的实践教学显示,改进后的方法相比原方法[10-12]准确度高、重现性好、结果更可靠。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器:紫外-可见分光光度计(TU-1810),2 cm石英比色皿,分析天平。

主要试剂:维生素C (分析纯),维生素E (分析纯),无水乙醇(分析纯),工业乙醇(分析纯,≥ 95%),硫酸(分析纯),醋酸(分析纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 维生素C和维生素E系列标准溶液的配制

称取0.0139 g维生素C和0.0488 g维生素E分别溶于无水乙醇中,再分别定量转移入500 mL容量瓶中,用无水乙醇稀释至标线,摇匀,得到浓度分别为27.8 mg∙L−1和97.6 mg∙L−1的维生素C和维生素E溶液备用。分别吸取上述溶液3.00、6.00、9.00、12.00、15.00 mL于5只洁净干燥的50 mL容量瓶中,用无水乙醇稀释至标线,摇匀,得到维生素C和维生素E系列标准溶液。

95%工业乙醇作为溶剂:将无水乙醇换成95%工业乙醇。其余步骤同上。

加入稀硫酸作为添加剂:在每个50 mL容量瓶中加入1 mL 0.1 mol∙L−1 H2SO4溶液,用无水乙醇稀释至标线,摇匀。其余步骤同上。

加入稀醋酸作为添加剂:在每个50 mL容量瓶中加入1 mL 0.2 mol∙L−1 HAc溶液,用无水乙醇稀释至标线,摇匀。其余步骤同上。

1.2.2 吸收光谱曲线的绘制

分别以相应乙醇溶剂为参比,在220–320 nm范围测定维生素C和维生素E的吸收光谱曲线,确定维生素C和维生素E的最大吸收波长分别作为λ1λ2

1.2.3 标准曲线的绘制

分别以相应乙醇溶剂为参比,在λ1λ2处测定维生素C和维生素E系列标准的各溶液的吸光度值。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.4 待测样品液的配制

取0.0410 g和0.1150 g维生素C和维生素E溶于无水乙醇中,定量转移入500 mL容量瓶中,用无水乙醇稀释至标线,摇匀。取2.5 mL未知液于50 mL容量瓶中,用无水乙醇稀释至标线,摇匀,则待测样品液中维生素C和维生素E的浓度分别为4.10 mg∙L−1和11.50 mg∙L−1

95%工业乙醇作为溶剂:将无水乙醇换成95%工业乙醇。其余步骤同上。

加入稀硫酸作为添加剂:取2.5 mL未知液于50 mL容量瓶中,加入1 mL 0.1 mol∙L−1 H2SO4溶液,用无水乙醇稀释至标线,摇匀。其余步骤同上。

加入稀醋酸作为添加剂:取2.5 mL未知液于50 mL容量瓶中,加入1 mL 0.2 mol∙L−1 HAc溶液,用无水乙醇稀释至标线,摇匀。其余步骤同上。

1.2.5 待测样品中维生素C和E含量的测定

测试待测样品液在最大吸收波长λ1λ2下的吸光度,重复3次取平均值,再通过标准曲线的线性方程,计算出待测液中维生素C和维生素E的浓度。公式如下[4]

$A_{{\lambda _1}}^{{\rm{C}} + {\rm{E}}} = \varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{C}}b{c_{\rm{C}}} + \varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{E}}b{c_{\rm{E}}}$

$A_{{\lambda _2}}^{{\rm{C}} + {\rm{E}}} = \varepsilon _{{\lambda _2}}^{\rm{C}}b{c_{\rm{C}}} + \varepsilon _{{\lambda _2}}^{\rm{E}}b{c_{\rm{E}}}$

即:

${c_{\rm{C}}} = \frac{{A_{{\lambda _1}}^{{\rm{C}} + {\rm{E}}}\varepsilon _{{\lambda _2}}^{\rm{E}} - A_{{\lambda _2}}^{{\rm{C}} + {\rm{E}}}\varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{E}}}}{{\left( {\varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{C}}\varepsilon _{{\lambda _2}}^{\rm{E}} - \varepsilon _{{\lambda _2}}^{\rm{C}}\varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{E}}} \right)b}}$

${c_{\rm{E}}} = \frac{{A_{{\lambda _1}}^{{\rm{C}} + {\rm{E}}} - \varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{C}}b{c_{\rm{C}}}}}{{\varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{E}}b}}$

式中,$A_{{\lambda _1}}^{{\rm{C}} + {\rm{E}}}$$A_{{\lambda _2}}^{{\rm{C}} + {\rm{E}}}$为待测样分别在波长λ1λ2处的吸光度;$\varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{C}}$$\varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{E}}$分别为维生素C和维生素E在波长λ1处的摩尔吸光系数;$\varepsilon _{{\lambda _2}}^{\mathop{\rm C}\nolimits} $$\varepsilon _{{\lambda _2}}^{\rm{E}}$分别为维生素C和维生素E在波长λ2处的摩尔吸光系数;cC:待测样中维生素C的浓度;cE:待测样中维生素E的浓度;b:比色皿厚度。

2 结果与讨论

2.1 不同添加剂的乙醇溶剂对维生素C标准曲线的影响

图2研究了以不同添加剂的乙醇为溶剂,维生素C质量浓度在1.0–10.0 mg∙L−1范围内对应的最大吸光度标准曲线。可以看出,当溶剂为无水乙醇时,最大吸光度与维生素C质量浓度具有一定的线性关系(图2a),所得标准曲线回归方程为:y= 0.0928x + 0.0265,线性相关系数R2 = 0.9817。相比之下,图2b中采用95%工业乙醇作为溶剂时线性拟合程度更高(R2= 0.9994)。工业乙醇一般另外含有甲醇、醛类、有机酸等杂质,根据维生素C的结构特性,我们推测线性拟合程度的提高可能主要来自其中酸性杂质的影响[9]。为了证实酸性添加剂的影响,同时尽量避免其余杂质对维生素C和维生素E本征光吸收性质的影响,我们在无水乙醇溶剂中加入适量的稀硫酸或稀醋酸,所得标准曲线也表现出较高的线性相关性(图2c2d),表明酸性添加剂使得测定结果更加准确可靠。

图2

图2   维生素C的标准曲线

(a)无水乙醇;(b) 95%工业乙醇;(c)无水乙醇加适量稀硫酸;(d)无水乙醇加适量稀醋酸


2.2 稀酸添加剂对维生素C和维生素E吸收光谱的影响

为了分析酸性添加剂改善维生素C测定准确性的原因,我们具体研究了无水乙醇中添加适量稀酸对维生素C和维生素E吸收光谱的影响。如图3a所示,当维生素C浓度为8.34 mg∙L−1时,其最大吸收波长分别在247和270 nm处,其中247 nm处为主吸收峰,对应于本征吸收,270 nm的吸收峰对应于脱氢维生素,与维生素E的292 nm处吸收峰部分重叠;当浓度降低至3.34 mg∙L−1时,其吸收光谱发生显著红移,270 nm吸收峰的强度增加;当浓度低于1.67 mg∙L−1时,最大吸收波长从247 nm红移至270 nm,与维生素E的吸收光谱重叠程度较高,这是由于维生素C的不稳定造成的,与文献的报道一致[9]。而当无水乙醇溶剂中添加适量稀酸如稀硫酸、稀醋酸时,维生素C的最大吸收波长稳定在245 nm处(图3b3c),进一步表明酸性添加剂通过提供氢离子的方式有效地抑制了维生素C的解离,增强了结构的稳定性,从而提高了检测的准确性。同时,稀酸添加前后维生素E的最大吸收波长没有明显移动(图3d–3f),表明对维生素E的结构影响不大。

图3

图3   维生素C和维生素E的吸收光谱

维生素C的吸收光谱:(a)无水乙醇,其中内插图为吸收光谱的拟合结果;(b)无水乙醇加适量稀硫酸;(c)无水乙醇加适量稀醋酸;维生素E的吸收光谱:(d)无水乙醇;(e)无水乙醇加适量稀硫酸;(f)无水乙醇加适量稀醋酸;
吸收光谱从低至高分别为取3.00、6.00、9.00、12.00、15.00 mL维生素C和维生素E储备液配制的标准溶液


稀酸添加剂对维生素C和维生素E结构稳定性的影响,可以通过最大吸收峰处的时间扫描曲线来说明。如图4a所示,浓度为3.34 mg∙L−1的维生素C在无水乙醇溶剂中,吸光度随时间延长显著下降,进一步证明了低浓度维生素C在无水乙醇溶液中较差的稳定性。在稀酸添加剂存在下,维生素C的吸光度随时间变化较小,充分说明了酸性添加剂有效增强了维生素C的结构稳定性,其中稀硫酸添加剂对维生素C结构的稳定作用最为理想,推测是源于其结构稳定、不易挥发的特性。相比之下,图4b中低浓度维生素E在无水乙醇溶液中能稳定存在,稀酸添加剂对维生素E的结构影响不大。

图4

图4   取6.00 mL储备液配制标准溶液的时间扫描曲线

(a)维生素C;(b)维生素E
测试条件:(1)无水乙醇;(2)无水乙醇加适量稀硫酸;(3)无水乙醇加适量稀醋酸


2.3 待测样品中维生素C和维生素E含量的计算

根据以上结果,我们选取稀硫酸作为添加剂同时测定待测样品中维生素C和维生素E的含量。稀硫酸添加前后,维生素C和维生素E在最大吸收波长λ1λ2下的标准曲线如表1所示。根据朗伯-比尔定律,解联立方程组,计算出$\varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{C}}$$\varepsilon _{{\lambda _1}}^{\rm{E}}$分别为0.0464和0.0014;$\varepsilon _{{\lambda _2}}^{\rm{C}}$$\varepsilon _{{\lambda _2}}^{\rm{E}}$分别为0.0012和0.0072,从而计算出待测液中维生素C和维生素E的含量,计算结果如表2所示。结果表明,采用无水乙醇为溶剂,测得待测液中维生素C和维生素E的浓度相对误差分别为13.65%和40.01%;而加入适量稀硫酸后,待测液中维生素C和维生素E的测定相对误差分别为1.98%和0.89%。通过以上对比,证实了在本实验中巧妙地引入酸性添加剂,可显著提高维生素C和维生素E同时测定的准确性。

表1   维生素C和维生素E的标准曲线

测试条件标准曲线
维生素C维生素E
λ1λ2λ1λ2
无水乙醇y = 0.0928x + 0.0265
(R2
= 0.9817)
y = 0.0027x + 0.0646
(R2 = 0.5842)
y = 0.0024x
− 0.0001
(R2 = 0.9900)
y = 0.0143x + 0.0002
(R2 = 0.9999)
无水乙醇加适量稀硫酸y = 0.1075x + 0.0124
(R2 = 0.9995)
y = −0.0006x + 0.0054
(R2 = 0.6452)
y = 0.0032x
− 0.0198
(R2 = 0.9876)
y = 0.0143x
− 0.0031
(R2 = 0.9999)

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表2   待测液的测定值与真实值的比较

溶剂λ1处吸光度λ2处吸光度测试cC/(mg∙L−1)测试cE/(mg∙L−1)cC相对误差/%cE相对误差/%
无水乙醇0.36720.23983.5416.1013.6540.01
无水乙醇加适量稀硫酸0.48660.16344.1811.601.980.89

待测液中维生素C、E的真实浓度分别为4.10 mg∙L−1和11.50 mg∙L−1

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3 结语

分光光度法同时测定维生素C和维生素E是一个典型的多组分同时测定设计实验,但目前的测试体系对维生素C测定的误差较大。本文通过对比95%工业乙醇替代无水乙醇作为溶剂对测试结果的影响,发现工业乙醇中的酸性杂质有助于稳定维生素C的结构,受此启发,对此设计实验进行了巧妙的设计与改进,通过在无水乙醇溶剂中添加适量酸,有效抑制了维生素C的解离,增强了结构的稳定性,从而获得了拟合程度更高的标准曲线线性回归方程,提高了维生素C和维生素E含量同时测定的准确性,带给学生更好的实践教学体验。以此设计性实验为例,引导学生在实验中注重观测、善于思考,并结合理论知识尝试设计并优化实验方案,以培养其提出问题、分析问题、解决问题的综合创新能力。

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