大学化学, 2020, 35(12): 2-8 doi: 10.3866/PKU.DXHX202008080

专题

新冠病毒刺突蛋白及其受体的结构与相互作用

杨海龙1,2, 刘允2, 杨斌,1

Structures and Interactions of SARS-CoV-2's Spike Protein and Its Receptor

Yang Hailong1,2, Liu Yun2, Yang Bin,1

通讯作者: 杨斌, Email: bin.yang@gzhmu.edu.cn

收稿日期: 2020-08-31   接受日期: 2020-10-15  

基金资助: 国家自然科学基金.  51903062
广东省基础与应用基础研究基金.  2020A1515011320

Received: 2020-08-31   Accepted: 2020-10-15  

摘要

生物化学是化学的分支,是研究生命物质的化学组成结构及化学变化的基础生命科学。新冠肺炎是全人类所面临的问题,本文以生物化学的视角,阐述新冠病毒的刺突蛋白及其受体人血管紧张素转化酶2的化学结构及其相互作用,对目前已发表的国内外相关研究进行总结,有望为新冠疫苗的研发提供参考。

关键词: 新型冠状病毒 ; 刺突蛋白 ; 血管紧张素转化酶2

Abstract

Biochemistry is a branch subject of chemistry, which is the study of chemical structures and processes associated with living organisms. COVID-19 pandemic is a problem for human beings. From the perspective of biochemistry, this paper demonstrates the chemical structure and interactions of SARS-CoV-2's spike protein and its receptor (human angiotensin converting enzyme 2), and summarizes the related research progresses. The authors hope to provide insights for the development of COVID-19 vaccine.

Keywords: SARS-CoV-2 ; Spike protein ; Angiotensin converting enzyme 2

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本文引用格式

杨海龙, 刘允, 杨斌. 新冠病毒刺突蛋白及其受体的结构与相互作用. 大学化学[J], 2020, 35(12): 2-8 doi:10.3866/PKU.DXHX202008080

Yang Hailong. Structures and Interactions of SARS-CoV-2's Spike Protein and Its Receptor. University Chemistry[J], 2020, 35(12): 2-8 doi:10.3866/PKU.DXHX202008080

2019年末,在湖北省武汉市陆续发现多例不明原因的病毒性肺炎病例,主要以干咳、发热、乏力为主要症状[1]。2020年1月12日,世界卫生组织正式将其命名为“2019-nCoV”(2019-novel Coronavirus),即“2019新型冠状病毒”,简称“新冠病毒”;2020年2月11日,国际病毒分类委员会宣布,将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2),即“严重急性呼吸综合征冠状病毒2型”。其导致的新型冠状病毒肺炎目前已被纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病,并按甲类传染病管理[2]。截至北京时间2020年9月30日06时,根据美国约翰斯∙霍普金斯大学发布的疫情统计数据,全世界累计确诊病例达到33484120例,累计死亡病例1004082例。

新冠病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科,β冠状病毒属,与2003年引发非典型肺炎的SARS病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV)同科同属不同种。SARS-CoV-2具有磷脂双分子层包膜,外形为表面有凸起的圆形或椭圆形颗粒,形似皇冠,直径60–140 nm;包膜上有刺突蛋白(Spike Protein,S蛋白),膜蛋白(Membrane Protein,M蛋白)、套膜蛋白(Envelop Protein,E蛋白)等;包膜内有和核壳蛋白(Nucleocapsid Protein,N蛋白)结合线性单股正链的RNA [3],基因组大小约30 kb。SARS-CoV-2感染宿主细胞是通过S蛋白与跨膜蛋白血管紧张素转化酶2 (Angiotensin Converting Enzyme 2,ACE2)结合介导的[4]

据Zhou等[5]的研究,利用NGS (Next-GenerationSequencing)技术检测SARS-CoV-2和SARS-CoV基因组发现,二者基因组的同源性达到79.4%。尽管SARS-CoV-2和SARS-CoV均属于β属冠状病毒,但后者的传染性明显不如前者,也是由于二者的S蛋白与ACE2结合能力不同导致的[6]

1 刺突蛋白及其受体的结构

1.1 刺突蛋白——病毒入侵细胞的主要元件

刺突蛋白(S蛋白)是病毒表面重要的标志蛋白,是一种三个相同亚基以非共价键结合成同源三聚体(图1) [7];同时S蛋白存在多个N-糖基化位点,糖基通过共价键与蛋白相连组成糖蛋白[8],而大量糖基的存在则可通过糖基化改变蛋白质分子的空间结构而封闭或破坏抗原表位,从而抑制机体产生免疫应答[9],对病毒起到保护作用。

图1

图1   SARS-CoV-2表面上S蛋白三聚体的结构分析[7]


据Wrapp等人的研究显示[6],S蛋白的每个亚基由1273个氨基酸残基构成,其多肽链由病毒基因组RNA编码,在细胞内直接经宿主核糖体翻译而来。S蛋白是一种跨膜蛋白,可以分为氨基端(N端)的S1亚单位和羧基端(C端)的S2亚单位,S1亚单位呈球状,负责跟细胞受体结合,S2亚单位呈柄状插入病毒包膜,负责介导随后的膜融合[10],受体结合和膜融合是SARS-CoV-2感染周期中的关键步骤。

S蛋白的序列主要包括N端结构域(N-Terminal Domain,NTD)、受体结合结构域(Receptor Binding Domain,RBD)、融合肽段(Fusion Peptide,FP)、2段七肽重复序列(Heptad Repeat,HR)、中央螺旋(Central Helix,CH)、连接域(Connector Domain,CD)、跨膜结构域(Transmembrane Domain,TD)等,同时还有S1/S2和S2’两个切割位点。

1.2 血管紧张素转化酶2——S蛋白的主要识别对象

过去血管紧张素转化酶2 (ACE2)的作用更多是在心血管系统中被人知晓,它是肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)一个关键的负调节因子,与其同源蛋白血管紧张素转化酶(ACE)作用相反[11]。ACE2已被证明是SARS-CoV的S蛋白感染细胞的主要受体[12],而SARS-CoV-2亦是如此。但是,常见的血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors,ACEI)如卡托普利和赖诺普利并不影响ACE2活性[13],目前也没有证据显示新冠病毒肺炎患者使用ACEI类药物导致症状加重[14]。ACE2高表达于肾脏、心脏和睾丸,但亦在肺、小肠和肝脏等组织表达[12],部分患者初期表现为呕吐、腹泻等消化道症状也可能与ACE2在肠道组织分布有关,也有报道指出部分患者粪便中SARS-CoV-2阳性[15]

ACE2是位于细胞膜表面的I型跨膜蛋白,是一种含有锌的羧肽酶。ACE2由805个氨基酸残基组成,具有单一的胞外催化结构域[16]。ACE2有两个结构域:N端催化结构域和C端结构域,N端催化结构域具有一个活性位点——锌结合基序,组成为组氨酸(His)-谷氨酸(Glu)-(X)-(X)-组氨酸(His) (HEXXH序列,X为任意氨基酸),它存在于多种肽酶中[17]。ACE2属于金属蛋白酶M2家族,活性位点暴露在细胞外表面,促进氨基酸的循环代谢。通过利用锌离子(在活性位点内由2个保守的组氨酸进行配位)进行催化反应,以促进底物蛋白肽键的水解,在HEXXH序列内,除了2个组氨酸,另一个谷氨酸也参与配位锌离子[18]

Yan等[19]的研究显示,ACE2可以以同源二聚体的形式存在于细胞表面,但这样的二聚体形式不稳定,ACE2还可以同氨基酸转运体B0AT1形成异源二聚体,以该异源二聚体为亚单位聚合成稳定的同源二聚体(同时包含2个ACE2和2个B0AT1)。ACE2二聚体具有开放(open)和关闭(closed)两种构象变化,但两种构象均含有SARS-CoV-2的识别位点。

2 刺突蛋白与受体的相互作用

2.1 S蛋白RBD与ACE2的结合

正常情况下,SARS-CoV-2的S蛋白以亚稳定的三聚体构象存在。当S1亚单位与宿主细胞受体结合时,宿主蛋白酶切割S蛋白的S1/S2切割位点,破坏了融合前三聚体的稳定性,导致S1亚单位脱落和S2亚单位转变为融合后的稳定构象[20]

SARS-CoV-2的S蛋白RBD包含有192个氨基酸残基,但是与SARS-CoV的S蛋白RBD同源性只有73.4%。据Wrapp等[6]通过表面等离子共振技术(SurfacePlasmon Resonance,SPR)研究显示,SARS-CoV的S蛋白与ACE2的平衡解离常数KD为325.8 nmol∙L−1,SARS-CoV-2的S蛋白与ACE2的KD为14.7 nmol∙L−1,而KD值越小说明解离越少,S蛋白与ACE2的亲和力越强,这也可以解释为何今年的新冠肺炎疫情较2003年的非典疫情传播更加迅速。

S蛋白主要通过位于S1亚单位的RBD来结合宿主细胞受体ACE2的肽酶域(PeptidaseDomain,PD),在RBD上存在受体结合序列(ReceptorBinding Motif,RBM)会特异性识别位于ACE2胞外域的PD [21],但不会影响ACE2的功能[16]

运用冷冻电镜对S蛋白三聚体的3个S1亚单位的观测表明[6, 22],RBD可以经历铰链式“开合”运动,对应两种不同的状态,称之为“向上(up)构象”和“向下(down)构象”。只有在RBD处于“向上构象”时抗原表位暴露才能与ACE2结合,这种状态被认为不太稳定[6];而RBD处于“向下构象”抗原表位隐藏则与ACE2无法相互作用。据Yuan等[23]研究显示,S1亚单位RBD与ACE2结合的抗原表位为氨基酸序列不连续的构象表位。

SARS-CoV-2的RBD立体构象有一个扭曲的五股反平行β折叠(标记为β1、β2、β3、β4和β7) (β折叠中,相邻肽链主链上的C=O与N-H之间形成氢键,氢键与肽链的长轴近于垂直),其中有短连接螺旋和环状结构,构成RBD核心区域[22]。在核心结构中的β4和β7折叠之间,存在一个包含短的β5和β6折叠、α4和α5螺旋及环的延伸插入结构,这就是RBM,它包含SARS-CoV-2与ACE2结合的大部分氨基酸残基[24]。在RBD中总共发现了9个半胱氨酸残基,其中8个形成了4对二硫键(一种维持蛋白质结构的重要共价键);这四对中,有三对在核心区域(Cys336–Cys361,Cys379–Cys432和Cys391–Cys525),这有助于稳定β折叠结构;其余的一对(Cys480-Cys488)连接RBM远端的环状结构(图2)。

图2

图2   SARS-CoV-2的RBD与ACE2结合的整体结构[24]


ACE2的N端有螺旋结构和PD,PD有两叶,在两叶之间有PD的底物结合位点。S蛋白与ACE2结合时,RBM与PD小叶的底侧接触,RBM凹的外表面与ACE2的N端螺旋结构接触,二者以非共价键结合[24]。ACE2的N端螺旋被RBM包裹,导致在SARS-CoV-2RBD与ACE2界面上有16.87 nm2的包埋面积(RBD上为8.64 nm2,ACE2上为8.23 nm2),这个界面一个显著特征是存在亲水相互作用的网络,包括13个氢键和2个静电引力,在截断半径为0.4nm的情况下,总共有17个RBD氨基酸残基与20个ACE2氨基酸残基接触。通过RBD-ACE2复合物与SARS-CoV-2 S蛋白的结构比对表明,2个S蛋白三聚体可以同时与1个ACE2同源二聚体结合[19]

2.2 S2亚单位介导的膜融合

S1亚单位介导受体结合,S2亚单位负责膜融合。膜融合是S蛋白激活的结果,并依赖于宿主细胞蛋白酶(如弗林蛋白酶)在S1/S2和S2’位点对S蛋白的切割,是病毒进入细胞不可缺少的一步[25]

SARS-CoV-2的S1/S2位点是一个含有多个精氨酸残基的暴露的环型结构,这与SARS-CoV有很大不同[6, 22]。这样的结构更加有利于弗林蛋白酶(Furin)切割,Furin的切割肽链中的精氨酸(Arg)-X-Y-精氨酸(Arg) (X为任意氨基酸,Y为精氨酸或赖氨酸)序列的羧基端肽键。

S蛋白在FP上游的所谓S2’位点被宿主蛋白酶进一步切割,促进不可逆的构象变化来激活S蛋白进行膜融合[22]。据Hoffmann与其同事[25, 26]的研究证实,跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane proteaseserines2,TMPRSS2)是S蛋白活化的重要媒介,帮助病毒进入细胞,是潜在的药物作用靶点。

据Xia等[27]的研究显示,SARS-CoV和SARS-CoV-2的S2亚单位有89.8%的序列同源性。S蛋白S1亚单位的RBD与靶细胞上的ACE2受体结合后,S蛋白S2亚单位的2段七肽重复序列HR1和HR2相互作用形成6股螺旋束(6-HB)的融合核心,使病毒和细胞膜紧密结合,便于融合和感染[28]

S蛋白三聚体的3个HR1结构域形成一个平行的三聚体盘绕中心,围绕该中心的三个HR2结构域以反平行的方式缠绕在一起。这两个结构域之间的相互作用主要是疏水作用力。每对相邻的两个HR1螺旋形成一个深疏水沟槽,为HR2结构域的疏水残基提供结合位点[25]。氨基酸序列比对表明,SARS-CoV-2和SARS-CoV在HR1和HR2区的同源性分别为92.6%和100%。与SARS-CoV相比,在HR1结构域的融合核心区内,SARS-CoV-2有8个氨基酸残基不同,晶体学分析表明,这可能有助于增强HR1和HR2之间的相互作用,稳定SARS-CoV-2的6-HB构象,有可能会导致新冠病毒的感染能力增强[25]

据Tang等[29]研究显示,将SARS-CoV与SARS-CoV-2融合肽的氨基酸序列的同源性为93%。S2亚单位从融合肽段(FP)开始,下游即为HR1和HR2,FP是S蛋白的膜融合功能元件。FP在冠状病毒家族S蛋白属于保守的短片段(15–25个氨基酸残基),主要由甘氨酸或丙氨酸等疏水氨基酸组成,插入宿主细胞膜以启动融合。

膜融合是一个多步骤过程,S蛋白激活后,FP会直接与宿主细胞膜相互作用,促进融合形成融合孔,病毒再通过融合孔将基因组RNA注入到宿主细胞内,复制产生更多的病毒。研究人员还发现,Ca2+有助于FP实现其功能,并促进SARS-CoV-2染宿主细胞[29]

3 总结与展望

目前,新冠疫情还在全世界肆虐,对SARS-CoV-2的研究仍在深入。科学家们围绕刺突蛋白进行了大量研究,解析其基因组和结构揭示了它与SARS-CoV的亲缘关系,并且为疫苗研发(包括灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗等)提供理论基础,通过模型重建分析确定了刺突蛋白和ACE2的相互作用力及作用位点,阐释了病毒入侵人体的机制并指导药物的研发工作。

新冠肺炎是全人类所面临的共同挑战,需要按照科学的方法,控制传染源,阻断传播途径,保护易感人群,方能有效阻止疫情的扩散,减轻医疗系统负担,减少疫情给社会各方面带来的不利影响;同时更需要各国科学家交流与合作,及时分享研究成果,研制出可靠的疫苗才能帮助人类对抗新冠病毒。

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