大学化学, 2020, 35(12): 118-126 doi: 10.3866/PKU.DXHX202010077

今日化学

浅谈2020年诺贝尔化学奖:通向未来的基因编辑

牛煦然, 周卓, 魏文胜,

A Brief Introduction to Nobel Prize in Chemistry 2020: Gene Editing for the Future

Niu Xuran, Zhou Zhuo, Wei Wensheng,

通讯作者: 魏文胜, Email: wswei@pku.edu.cn

收稿日期: 2020-10-28   接受日期: 2020-11-9  

基金资助: 国家自然科学基金重点项目.  NSFC31930016
北京市科委生物医学前沿创新推进项目.  Z181100001318009

Received: 2020-10-28   Accepted: 2020-11-9  

作者简介 About authors

魏文胜,北京大学生命科学学院教授,目前同时担任北京大学生物医学前沿创新中心(BIOPIC)、北京未来基因诊断高精尖创新中心(ICG)及北大-清华生命科学联合中心(CLS)研究员,任北京大学基因组编辑研究中心主任课题组致力于发展基于基因组编辑技术的高通量功能基因组学、开发新型基因编辑技术并应用于基因治疗,研究癌症、感染等重大疾病发生机制,为发展高效治疗手段提供新的药物靶点和思路 , E-mail:wswei@pku.edu.cn

摘要

2020年诺贝尔化学奖授予了Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier这两位女科学家,以表彰她们在CRISPR技术发明上所做出的重要贡献。CRISPR系统通过向导RNA和核酸酶Cas蛋白在基因组上特定位点进行序列编辑,有着高效、精准和可设计等特点,已经被广泛应用于基础生物学研究、基因治疗和动植物育种等诸多领域,并引起了现代生物学领域的巨大技术变革。本文从基因编辑与CRISPR技术的发现和发展入手,对该技术和它相关的科学故事进行简要总结和评论。

关键词: 诺贝尔化学奖 ; CRISPR ; 基因编辑

Abstract

The 2020 Nobel Prize in chemistry was awarded to two female scientists, Jennifer Doudna and Emmanuelle Charpentier, to recognize their seminal contribution to the invention of CRISPR technology for genome editing. CRISPR system enables new generation of gene editing through RNA-based recognition of double-stranded DNA. Empowered by its high efficiency, accuracy and programmability, CRISPR technology has revolutionized modern biology, and has been widely applied in basic research, gene therapy, animal and plant breeding. Here, we briefly introduce the discovery of CRISPR system and the scientific stories behind, and discuss the on-going development and future directions of many gene-editing related technologies.

Keywords: Nobel Prize in chemistry ; CRISPR ; Gene editing

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本文引用格式

牛煦然, 周卓, 魏文胜. 浅谈2020年诺贝尔化学奖:通向未来的基因编辑. 大学化学[J], 2020, 35(12): 118-126 doi:10.3866/PKU.DXHX202010077

Niu Xuran. A Brief Introduction to Nobel Prize in Chemistry 2020: Gene Editing for the Future. University Chemistry[J], 2020, 35(12): 118-126 doi:10.3866/PKU.DXHX202010077

2020年10月7日下午5点48分,备受瞩目的诺贝尔自然科学奖的压轴项目——化学奖揭晓了。瑞典皇家科学院常任秘书Goran K. Hansson宣布,2020年诺贝尔化学奖授予美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和现在德国柏林马克斯∙普朗克病原学研究室工作的法国科学家Emmanuelle Charpentier (图1),用以表彰她们开发了一种新的基因组编辑方法:CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9)。自2012年这项振奋人心的技术正式诞生到它的发明人摘得诺贝尔奖桂冠,只用了8年时间,反映出这项工作的巨大意义与价值。我们希望用此文简要回顾CRISPR技术的发明和发展应用,试图说明该技术为何在短时间内掀起了科学界的巨大变革,并深刻影响了现代生物科技与人类生活。

图1

图1   获得2020年诺贝尔化学奖的两位科学家

图源自两位科学家实验室个人主页


1 基因与基因编辑

1.1 与基因相关的几个重要科学问题

长久以来,人们一直在试图通过各种努力回答这样几个问题:基因是什么?我们能否读懂生命的密码进而改写基因?如果可以对基因进行编辑,能为人类生命健康带来什么好处?

伴随着萨顿、摩尔根、艾弗里、沃森和克里克等一系列先驱人物的探索与发现,我们已经知道基因是具有遗传效应的DNA片段,而它的真正奥秘就蕴含在A (腺嘌呤)、G (鸟嘌呤)、C (胞嘧啶)和T (胸腺嘧啶)这四种碱基的排列组合中。随着桑格测序法的诞生,读出基因序列已经不是难题;在组学与生物信息学迅速发展的近20年来,读懂、注释并整理遗传信息的含义已经成为成熟的技术体系。然而,真正实现对于生物本身基因的“编辑”,一直是多年来生物学家孜孜以求的目标。

1.2 基因编辑与它的原理

近10年来,随着人工核酸酶技术的发展,对于基因的改造已经突破了基因重组及基因在个体/物种间转移,迈入了使用一把分子剪刀对基因进行高效且精准编辑的时代。

除了CRISPR/Cas系统之外,还有大范围核酸酶技术(meganuclease)[1],锌指核酸酶技术(zinc finger nuclease, ZFN) [2]和转录激活因子样效应物核酸酶技术(transcription activator-like effector nuclease, TALEN) [3]。这些人工核酸内切酶能够在基因组上精确诱导DNA发生双链断裂。因为DNA是一个双链结构,两条链的同时断裂意味着将这条储存着遗传信息的染色体一分为二,细胞必须迅速对其进行修复。多数时候,细胞通过非同源末端连接的方式将断裂的DNA重新连接起来,在这一修复过程中,重新连接的位置往往出现不同长度DNA片段的插入或删除,因而产生移码突变导致基因表达出错和功能失活。如果此时细胞中存在与断裂位点附近序列同源的DNA模板,细胞有机会利用同源重组的方式进行修复,从而实现对基因组上特定位点的精确插入、删除或者碱基替换[4]。这就像对一本书进行编辑,我们既可以成段删除文字,加入新内容,也可以纠正一两个错别字或者添加标点符号。而生物学家想要操纵的就是人类基因组这本大书,通过基因组编辑(genome editing)技术实现对生命密码的精准修改或调控。

2 CRISPR的前世今生

2.1 原核生物给我们的启迪

如上文所述,在CRISPR技术诞生之前,基于ZFN、TALEN等核酸酶系统的基因编辑技术已经相继登场并在基础研究和临床医学之间搭起了桥梁。这两种技术的出现无一例外都是科学家从自然界已有的生物系统中获得的启发。ZFN技术中的核心元件——锌指蛋白是科学家从非洲爪蟾的转录因子中发现[5],而TALEN技术中所用到的识别和结合基因组的元件最早来自于植物病原体黄单胞菌属中发现的一种avrBs3蛋白[6],后来被命名为转录激活因子样效应物[7]:TALE。这两种技术都启示我们,在大自然中蕴藏着无数的生命奥秘,对这些自然奥秘的探究还将继续催生出无数造福人类的新技术。

CRISPR的历史也与原核生物机制研究密不可分。时光倒流到1987年,日本大阪大学的Yoshizumi Ishino (石野良纯)等人很偶然地在大肠杆菌的基因组上发现,在一个名为iap的基因序列中存在长度为29个碱基对(bp)的高度重复同源序列,且这些重复序列被长度为32-bp的序列间隔开[8]。当时Yoshizumi Ishino和他的同事们并不知道这一现象的原理和生物学意义,因此在论文中给科学界留下了一个悬念。两年之后,在西班牙阿里坎特大学读博士的年轻学生Fransisco J. M. Mojica在对地中海嗜盐菌进行研究时,在其基因组上同样发现了类似的重复序列[9]。之后几年,Mojica相继在沃氏嗜盐富饶菌[10]、结核分枝杆菌、艰难梭菌及鼠疫杆菌等20余种不同的微生物类群中发现了这一特征,并将这一重复序列命名为Short Regularly Spaced Repeats (SRSRs) [11]

2002年,荷兰乌得勒支大学的Ruud Jansen课题组利用生物信息学分析工具对一系列古菌和细菌的重复序列进行了鉴定,并与Mojica一同为这类重复序列起了新名字:Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats,也就是我们现在所熟知的CRISPR [12]。经过众多科学家的持续研究(表1),我们终于知道CRISPR本质上是一种原核生物抵御外界病毒入侵的免疫系统。聪明的原核生物将外界入侵的病毒(如噬菌体)核酸序列留下一部分片段插入到自己的基因组,作为终生“记忆”的蓝本;而Cas (CRISPR-associated proteins)核酸酶,即是原核生物在病毒再次入侵后切割病毒核酸的工具剪刀(图2)。原核生物用这种方法保护了自己,也给科学家打开了探索基因编辑技术的新思路。

表1   CRISPR/Cas诞生发展史大事记

年份科学家内容
1987Yoshizumi Ishino首次在大肠杆菌中观察到特殊的重复序列[8]
1993Fransisco J. M. Mojica在地中海嗜盐菌中观察到特殊的重复序列[9[
1995Fransisco J. M. Mojica在沃氏嗜盐富饶菌嗜盐古菌中观察到类似重复序列[10]
2000Fransisco J. M. Mojica在结核分枝杆菌等20余种微生物中发现类似序列,并命名为SRSRs [11]
2002Ruud Jansen首次将这个重复序列命名为CRISPR,并鉴定了嗜热链球菌与酿脓链球菌的cas1-4基因[12]
2005Fransisco J. M. MojicaIn Silico层面发现了CRISPR与噬菌体的关系[13]
2007Philippe Horvath首次通过实验证明原核生物中CRISPR/Cas系统的免疫机制[14]
2008John vander Oost首次通过程序设计基于CRISPR的免疫机制的实验[15]
2008Luciano Marraffini证明CRISPR的靶标是DNA [16]
2010Sylvain Moineau发现嗜热链球菌中的CRISPR/Cas9系统是由crRNAs指引并且在DNA中造成双链断裂[17]
2011Emmanuelle Charpentier发现tracrRNA [18]
2011Virginijus Siksnys首次在远缘细菌物种中重建CRISPR,并证明Cas9的重要性[19]
2012Doudna与Charpentier首次利用CRISPR/Cas系统在体外对DNA进行切割[20]
2012Virginijus Siksnys利用CRIPSR/Cas系统在体外对DNA进行切割[21]
2013Feng Zhang首次利用CRISPR/Cas系统实现对人类细胞进行基因组编辑[22]
2013George M. Church首次利用CRISPR/Cas系统实现对人类细胞进行基因组编辑[23]
2013Jennifer A. Doudna利用CRISPR/Cas系统实现对人类细胞进行基因组编辑[24]

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图2

图2   CRISPR/Cas9源于细菌的免疫系统

图片来源于https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020/press-release/


2011年8月,立陶宛维尔纽斯大学的Virginijus Siksnys在Nucleic Acids Research杂志上发表了首次在远缘细菌物种内重建CRISPR的研究论文。在这项研究中,Siksnys课题组将嗜热链球菌的整个CRISPR基因位点转入到大肠杆菌内,发现这种重建的CRISPR系统仍然可以实现对质粒和噬菌体DNA的靶向干扰。在这项工作中,Siksnys还证明了Cas9是原核生物进行外源DNA干扰活动唯一必需的蛋白,而它的RuvC和HNH核酸酶结构域对其活性不可或缺[19]

2.2 CRISPR的诞生

20年来,前人积累的知识让工具化的CRISPR/Cas系统呼之欲出。从表1中可以看出,截止到2011年,我们现如今所需的CRISPR/Cas9系统的三个必要元件:crRNA、tracrRNA和Cas9已经全部被发现,它们各自的重要功能也得到证实。CRISPR/Cas系统的诞生,只差把这三样重要元件组合在一起并使其发挥基因编辑的功能。

2012年8月,加州大学伯克利分校的Doudna与当时还在瑞典Umeå大学工作的法国科学家Charpentier两个团队合作在Science上发表了一篇利用CRISPR/Cas9系统在体外对DNA进行精确切割的论文[20]。他们在文章中所使用的(也是目前为止应用最广泛的)是一种来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9 (SpCas9)蛋白。在这篇文章中,她们还将天然介导Cas9进行DNA切割的引导RNA:crRNA与tracrRNA合并成一条单链RNA——这也是目前广泛应用的sgRNA。至此,CRISPR作为一项在概念上被证明的基因编辑技术正式诞生了。

需要指出的是,Siksnys课题组几乎同时发现并报道了类似结果。他们利用在大肠杆菌里建立的异源表达系统,使用链酶亲和素标记物标记Cas9来纯化嗜热链球菌的Cas9-crRNA复合体,并在试管内同样观察到了复合物对DNA的切割。同时他们还对Cas9的RuvC结构域以及HNH结构域结合的DNA链进行了研究[21]。很遗憾,Siksnys于2012年4月6日向Cell杂志提交的论文被拒稿,这篇工作最终于2012年9月发表在PNAS。通过这项工作,Siksnys同样清楚地表明:“这些发现为构造普遍可设计的RNA引导的DNA核酸内切酶铺平了道路。”

2013年的1月3日,两篇Science论文登上了历史舞台。一项工作来自MIT Broad研究所的张锋团队,第一次实现了CRISPR系统在人源细胞系中的基因组编辑[22]。另一项工作来自于哈佛大学医学院的George M. Church团队。Church团队将crRNA-tracrRNA的结合物命名为gRNA (guide RNA),并对人的诱导多能干细胞进行了编辑[23]。随后的1月29日,Doudna团队在eLife杂志报道了使用spCas9系统对人源细胞系进行基因组编辑的研究成果[24]。上述工作的完成,标志着CRISPR/Cas技术真正成为了一项可以在真核细胞中操作的基因编辑工具(图3)。这个新系统利用小巧精短的RNA (长度通常为20-nt)介导序列定位,避免了ZFN和TALEN系统蛋白组装困扰。同时该系统根据目标DNA序列直接设计向导RNA,极大降低了基因编辑的操作门槛。短时间内,这项新技术火遍了全球,成为生物学家的“宠儿”。

图3

图3   CRISPR/Cas9技术原理

图片来源于https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020/press-release/


2.3 CRISPR系统的进一步发展与应用

在CRISPR/Cas技术问世后,张锋研究组开发出了一系列拓展工具,比如发现更小的、方便腺病毒载体组装的SaCas9 [25],产生粘性末端切割的Cas12a (亦称为Cpf1)[26]和具有更高特异性的突变体eSpCas9 [27]。同时,他也进一步发现了识别和结合RNA的Cas13 [28],将基于CRISPR/Cas的编辑领域从DNA拓展到RNA。

而张锋在Broad研究所的同事David R. Liu等人则从另一个角度拓展了CRISPR编辑系统。他们将失去切割活性的dCas9 (dead Cas9)或者产生单链切口的nCas9 (nickase Cas9)与胞嘧啶脱氨酶(如APOBEC1) [29]或他们进化得到的腺嘌呤脱氨酶TadA*[30]结合,实现了可以将C突变成T或A突变成G的单碱基编辑器。单碱基编辑技术避免了CRISPR/Cas切割造成的DNA的双链断裂,且不依赖于易错的非同源末端链接修复或低效的同源重组修复机制,避免了内源修复机制所带来的诸多弊端。

和其他多种工具酶的融合使用也是CRISPR系统的重要拓展。比如张锋等将转座酶与CRISPR系统结合,开发出了CAST (CRISPR-associated transposase)系统,可以在基因组上精确插入较大片段[31];David R. Liu将逆转录酶引入CRISPR系统,新设计的PE (prime editor)系统有望实现包括插入、删除、碱基转换和颠换在内的全部编辑操作[32]

在不影响基因组序列的前提下,CRISPR系统可以用来调控基因表达。比如将转录抑制元件(如KRAB)与dCas9结合,就可以得到抑制基因表达的CRISPRi (CRISPR interference)系统[33];将转录激活元件(如VP64)与dCas9结合,就可以得到激活基因表达的CRISPRa (CRISPR activation)系统[34]

而CRISPR/Cas9系统和高通量筛选和测序技术的结合,催生出高通量功能基因组学技术,不仅可以实现蛋白编码基因的功能性筛选[35-38],还可以实现非编码RNA的功能性筛选[39-41]。同时,由于它能有效进行基因的敲除,大大缩短了动物模型构建的时间[42]。CRISPR高效的基因操作能力也为遗传疾病的基因治疗提供了强大工具,它简洁的系统相比于ZFN和TALEN更适宜腺相关病毒的包装[43]。在核酸检测[44]、动植物育种等方面[45, 46],CRISPR的身影同样活跃。这项技术全方位影响和促进了现代生物学研究的几乎所有领域。

3 再评2020年化学诺奖

早在CRISPR/Cas正式诞生还不到3年的时候,大家就开始对这一技术的发明者能否获得诺奖议论纷纷。对这项技术的发明,Doudna和Charpentier无疑做出了最为关键的工作,第一次证明了CRISPR/Cas系统可以用于基因编辑,获得今年诺贝尔化学奖是实至名归。她们的工作是纯生物化学研究,更贴合化学奖这一主题。此外,Charpentier最早发现了tracrRNA [18],作为结构生物学家的Doudna也对Cas9及其复合物的复杂晶体结构进行了深入解析(图4) [47-49]。她们二人也分享过2014年的生命科学突破奖(The Breakthrough Prizes of Life Sciences),2015年西班牙的阿斯图里亚斯女亲王奖(Premios Princesa de Asturias)中的科学技术奖项和2017年的Japan Prize,这都充分说明两位科学家的杰出工作获得了广泛、高度的认可。

图4

图4   Cas9/DNA/sgRNA复合物结构[49]


诺贝尔奖花落谁家,是人们津津乐道的话题。由于单项诺贝尔奖获得者的人数限定为三人,经常会有遗珠之憾。Siksnys与Doudna和Charpentier完成了类似的工作,可能是因为论文发表的滞后导致他没有能够获奖。同样,CRISPR的诞生与之后的发展也有以张锋为代表的无数科学家的努力,不管得奖与否,所有为这一重要技术发明做出过贡献的科学家都值得铭记。

4 展望未来

回到关于基因的三个科学问题,伴随它们逐一获得解决,展示了现代生物学与生命医学发展的一段重要里程。作为基因编辑明星技术,CRISPR编辑系统的发明极大推动了生命科学研究领域的发展,它的未来十分值得关注和期待。

CRISPR系统并非完美无缺,其中最关键的是脱靶问题。科学家们为此提出了很多方案,比如改良出精度更高的Cas蛋白变体[50, 51],但是对脱靶的预测性和规避性仍然没有降到最低。此外,CRISPR还有进一步拓展的空间,比如挖掘具有不同编辑特性的新型Cas系统。当然,这项技术在基因治疗方面的推广应用也十分重要。CRISPR的主要发明者纷纷成立了基因治疗公司(如张锋的Editas Medicines,Charpentier的CRISPR Therapeutics,Doudna的Intellia Therapeutics,Church的Poseida Therapeutics等)。展望未来,毫无疑问还会有各种更为强大的生物技术被发明出来,有可能包括新型基因编辑工具,就像CRISPR的发明一样革命性地推动生命科学研究和疾病治疗,为人们的生活与健康带来更多的福音。

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