大学化学, 2021, 36(4): 2005044-0 doi: 10.3866/PKU.DXHX202005044

化学实验

pH响应纳米粒子的制备及应用综合实验

刘阳,, 刘琦

Comprehensive Experiment on Preparation and Application of pH-Responsive Nanoparticles

Liu Yang,, Liu Qi

通讯作者: 刘阳, Email: yliu@nankai.edu.cn

收稿日期: 2020-05-15   接受日期: 2020-07-4  

基金资助: 科技部重点研发专项“纳米科技”.  2018YFA0209700

Received: 2020-05-15   Accepted: 2020-07-4  

Abstract

In order to provide students with a more in-depth and intuitive understanding of the development and application of polymer materials in the field of nanotechnology, a comprehensive experiment was designed to focus on the design and biomedical applications of a novel-structured pH-responsive nanoparticle. This comprehensive experiment includes the synthesis of a pH-responsive block co-polymer via ring-opening polymerization, preparation of pH-responsive nanoparticles, and characterization and analysis of the polymer and the nanoparticles. This experiment helps students to understand the design principle and the basic processes of the preparation and characterization of polymer nanomedicine. This experiment involves the application of polymer science in the field of nanomedicine, which helps students to cultivate the ability to analyze and solve scientific problems, and stimulates the interest in exploring the frontiers of scientific research.

Keywords: Polymer chemistry ; Nanomedicine ; pH response ; Polymer materials

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本文引用格式

刘阳, 刘琦. pH响应纳米粒子的制备及应用综合实验. 大学化学[J], 2021, 36(4): 2005044-0 doi:10.3866/PKU.DXHX202005044

Liu Yang. Comprehensive Experiment on Preparation and Application of pH-Responsive Nanoparticles. University Chemistry[J], 2021, 36(4): 2005044-0 doi:10.3866/PKU.DXHX202005044

纳米医学作为前沿交叉学科,其研究内容涵盖化学、材料学、生物学和医学等多个学科[1]。近年来,纳米药物相关研究发展迅速,特别是针对肿瘤治疗中提升药物生物利用度和降低药物毒副作用等方面效果显著,展现出巨大的应用潜力,多个纳米药物已经应用于临床疾病的治疗[2, 3]。纳米药物最关键的部分为纳米药物递送系统/纳米药物载体,其通常由天然高分子(如多糖、蛋白质等)或化学合成材料(如磷脂、聚合物、多孔硅等)构成[4-6]。纳米药物载体通常本身没有生物调控功能,其主要功能为负载具有生物活性的物质(如小分子药物、基因、多肽等),并将其运送和释放于目标组织和细胞,从而使药物可以高效、准确地富集并作用于目标组织,提升药物治疗效果,同时降低对正常组织的影响,减轻药物的副作用[7, 8]。为实现这个目的,纳米药物载体通常需要通过表面性质调控的方式来适应其所在的生物微环境,例如可通过提升纳米药物载体表面的正电荷提高其在组织中渗透和进入细胞内的效率,或通过对纳米载体表面进行聚乙二醇(PEG)修饰延长其血液循环时间[9]。但在抗肿瘤药物设计过程中,由于多数药物需通过静脉给药,其到达肿瘤细胞前必然经历血液循环、组织渗透及进入细胞等多个不同的生物微环境,而这些生物微环境对于纳米载体表面性质需求不同甚至存在矛盾。因此,如何实现纳米药物载体表面性质对生物微环境的动态适应,成为这一领域研究的热点问题,对于纳米药物相关研发和应用有重要的意义。

近年来,新型环境响应性聚合物材料的研发以及自组装技术的快速发展为上述问题的解决提供了可行的方案。利用环境响应性聚合物构建的纳米药物载体可随生物微环境信号(如温度、pH、氧化自由基浓度、特定酶含量等)变化改变其表面物理化学性质,从而实现对药物递送全过程的动态适应,实现对药物递送效率的显著提升[10, 11]。针对抗肿瘤纳米药物的开发,肿瘤的酸性微环境(pH < 6.8)是实体肿瘤区别于正常组织(pH = 7.4)的一个显著特征[12]。基于这个特征,本实验设计了一种pH响应纳米粒子实现对质粒DNA (pDNA)的肿瘤靶向递送,用以展示实现癌症基因治疗纳米药物体系的设计思路。如图 1所示,这种pH响应纳米粒子具有核-壳结构,其中内核是由聚乙烯亚胺(PEI25K)和pDNA组成的正电性复合物,负电性的pH响应性聚合物通过静电相互作用吸附到正电性的PEI25K/pDNA复合物内核表面形成聚合物外壳。在正常生理pH条件下,pH响应纳米粒子具有一层PEG外壳,但在肿瘤酸性微环境中,pH响应纳米粒子会脱除聚合物壳层暴露出正电性的内核。由于肿瘤细胞的细胞膜表面通常带负电,纳米粒子正电性的内核可通过静电相互作用与细胞膜结合,从而促进肿瘤细胞对纳米粒子的摄取[13]。本实验设计包含pH响应性聚合物的合成,大分子自组装及pH响应纳米粒子的制备,pH响应性能的表征与分析,肿瘤细胞对纳米粒子的摄取以及细胞转染等实验。实验内容贴近目前生物医用高分子及纳米医学领域的研究前沿,有利于激发学生对科研探索的兴趣;另一方面,本实验涉及化学、材料学以及生物学多学科知识,覆盖相关研究的基本研究方法和相关实验操作,可以有效锻炼学生的综合实验能力以及问题分析能力,通过综合利用多学科研究方法和手段解决实际问题的过程,引导和提高学生的科研创新能力[14, 15]

图1

图1   pH响应纳米粒子的制备以及响应过程示意图


1 试剂与仪器

试剂:四氢呋喃(分析纯)、正己烷(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、乙酸(99%)购自天津渤化化学试剂有限公司;超干二甲基甲酰胺(99.8%)、N-苄氧羰基-L-赖氨酸(98%)购自百灵威科技有限公司;三光气(99%)、氢溴酸(48%)购自天津希恩思生化科技有限公司;氢氧化钠(99%)、碳酸钠(99%)购自天机化学试剂批发公司;2, 3-二甲基马来酸酐(98%)、丁二酸酐(97%)购自安耐吉化学试剂有限公司;单甲氧基聚乙二醇胺(MW:5000;95%)购自上海金畔生物科技有限公司;4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(95%)、罗丹明标记的鬼笔环肽(99%)购自美国Invitrogen公司,所有试剂在均无需预处理,直接应用于实验过程中。

仪器:核磁共振仪(美国Varian公司)、激光共聚焦荧光显微镜(日本Olympus公司FV1000)、电动搅拌器(RH basic IKA)、荧光显微镜(日本Olympus公司CX41),动态激光光散射仪(美国布鲁克海文仪器公司BI-200SM),流式细胞仪(美国Guava公司EasyCyte 8HT)。

2 实验步骤

2.1 pH响应性聚合物的合成

称取N-苄氧羰基-L-赖氨酸5.35 g (18.4 mmol),加入250 mL圆底三口瓶中,同时加入重蒸四氢呋喃(THF) 100 mL,然后缓慢加入溶有8.5 g (27.6 mmol)三光气(BTC)的THF (50 mL),在氮气氛围保护下,70 ℃油浴搅拌条件下反应2 h,待反应液澄清之后,用氩气除去烧瓶中的残余BTC。浓缩反应液快速加入预先准备好的过量正己烷中,4 ℃静置沉淀、抽滤得到淡黄色固体,加入适量乙酸乙酯/正己烷混合溶液(体积比为1 : 1)加热溶解至微沸,趁热过滤除去不溶物,得到饱和的N-苄氧羰基-L-赖氨酸酐(Lys(Z)-NCA)溶液,静置析出结晶,抽滤,得到Lys(Z)-NCA白色固体(产量4.96 g,产率:85%)。将Lys(Z)-NCA (0.98 g,3.2 mmol)溶解在30 mL超干二甲基甲酰胺中,加入单甲氧基聚乙二醇胺(MW:5000,2.0 g,0.4 mmol)作为引发剂进行开环聚合。将反应混合物在40 ℃下搅拌48 h,然后减压蒸发溶剂,所得产物溶于15 mL氯仿中,然后缓慢加入过量的冰乙醚得到mPEG113-b-PLys100(Z)固体。在4 ℃条件下,使用氢溴酸/乙酸混合液(体积比为1 : 3,2 mL)溶解mPEG113-b-PLys100(Z)固体,并缓慢滴入到20 mL的三氟乙酸(TFA)中进行脱保护去除mPEG113-b-PLys100(Z)中的苄氧羰基。搅拌反应2 h后,将反应混合物滴加到过量冰乙醚中沉淀得到单甲氧基聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物(mPEG113-b-PLys100)粗产物。将粗产物重新溶解在DMF中,使用220 nm微孔过滤器过滤纯除去不溶物。滤液继续在过量的冰乙醚中沉淀以除去残留的TFA得到mPEG113-b-PLys100,最后将产物在室温下真空干燥(合成流程见图 2)。

图2

图2   pH响应高分子合成流程图


为了对mPEG113-b-PLys100进行功能化修饰,将100 mg mPEG113-b-PLys100溶解在10 mL pH = 8.5的50 mmol∙L-1的碳酸氢钠缓冲溶液中,然后加入211.2 mg 2, 3-二甲基马来酸酐(DMMA)反应,在整个反应过程中不断滴加0.2 mol∙L-1的氢氧化钠溶液使整个反应体系的pH保持在8.0–8.5。反应结束后,使用透析袋(截留分子量:3500 Da)室温透析(透析液:1 L蒸馏水;换液4次) 24 h将未反应的2, 3-二甲基马来酸酐除去,然后冻干透析袋中液体得到pH响应性聚合物(mPEG113-b-PLys100/DMMA)。同时用丁二酸酐(SA)替代DMMA按照同样的方法得到不具有pH响应性的聚合物mPEG113-b-PLys100/SA (图 2)。

2.2 pH响应纳米粒子的制备

在室温下,将PEI25K和编码tdTomato荧光蛋白的pDNA分别溶解于PBS中配成1 mg∙mL-1 (PEI25K)和250 μg∙mL-1 (pDNA)溶液,等体积混合PEI25K (1 mg∙mL-1,0.5 mL)和pDNA (250 μg∙mL-1,0.5 mL)搅拌孵化15 min形成正电性的纳米复合物PEI25K/pDNA。随后将溶于磷酸盐缓冲液(PB,10 mmol∙L-1,pH 7.4)的pH响应性高分子mPEG113-b-PLys100/DMMA (0.5 mL,1 mg∙mL-1)与正电性的纳米复合物PEI25K/pDNA (1 mL,625 μg∙mL-1)混合搅拌15 min得到pH响应性纳米粒子。同时使用mPEG113-b-PLys100/SA替代mPEG113-b-PLys100/DMMA按照同样的方法得到非pH响应纳米粒子作为对照。

2.3 pH响应性能测试

聚合物的pH响应性测试:使用氘代水和磷酸二钠氘分别配制pH 6.5和pH 7.4的氘代磷酸盐缓冲液(100 mmol∙L-1)。将100 μg的mPEG113-b-PLys100/DMMA和mPEG113-b-PLys100/SA分别加入pH 6.5和pH 7.4的氘代磷酸盐缓冲液中室温孵育2 h,然后核磁共振波谱仪对其孵育前后的聚合物进行表征。

纳米粒子的pH响应性测试:向pH响应纳米粒子(0.5 mg∙mL-1,0.2 mL)溶液中分别加入pH 7.4和pH 6.5的PBS (100 mmol∙L-1,0.8 mL)室温搅拌孵育2 h。同样,向非pH响应纳米粒子(0.5 mg∙mL-1,0.2 mL)溶液中分别加入pH 7.4和pH 6.5的PB (100 mmol∙L-1,0.8 mL)室温搅拌孵育2 h。然后使用Zeta电位仪测量孵育前后pH响应纳米粒子和非pH响应纳米粒子表面Zeta电位。

pH响应纳米粒子在不同pH下的稳定性:向pH响应纳米粒子(0.5 mg∙mL-1,0.2 mL)溶液中分别加入pH 7.4和pH 6.5的含有10% FBS的PBS (100 mmol∙L-1,0.8 mL)并在室温下孵育,然后使用动态激光散射仪观察孵育过程中pH响应纳米粒子粒径的变化。

2.4 肿瘤细胞对pH响应型纳米粒子的摄取

MDA-MB-231细胞购自中国科学院上海细胞库,采用含有10%热灭活胎牛血清(FBS)、青霉素(100 units∙mL-1)、链霉素(100 units∙mL-1)的DMEM培养基,并在37 ℃的含有5% CO2的细胞培养箱中进行培养。

为了直接观察肿瘤细胞对纳米粒子的摄取,首先向pDNA (0.25 mg∙mL-1,2 mL)中加入绿色荧光探针YOYO-1溶液(1 mg∙mL-1,20 μL),并在4 ℃条件下搅拌反应2 h得到YOYO-1标记的pDNA。随后将MDA-MB-231细胞以每孔10000个细胞的密度接种到24孔板中,并在含10% FBS的0.5 mL DMEM培养基中培养过夜。为了观察肿瘤细胞在不同条件下对pH响应纳米粒子的摄取能力,使用盐酸将培养基的pH预先调节至pH 7.4或6.5。然后分别加入使用YOYO-1 (绿色荧光探针)标记的pDNA制备的pH响应纳米粒子(0.5 mg∙mL-1,50 μL)和非pH响应纳米粒子(0.5 mg∙mL-1,50 μL),在不同pH (pH 7.4或者pH 6.5)的培养基中与肿瘤细胞共孵育2 h。孵育结束后,PBS冲洗三遍并用4%多聚甲醛固定15 min。按照说明书,继续使用4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,蓝色)对细胞核进行染色,使用罗丹明标记的鬼笔环肽(红色)对细胞膜进行染色。染色结束后,使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞并拍照。为了定量分析肿瘤细胞对纳米粒子的摄取情况,将MDA-MB-231细胞以每孔100000个细胞的密度接种到6孔板中,并在含10% FBS的2 mL DMEM培养基中培养过夜。为了观察肿瘤细胞在不同条件下对pH响应纳米粒子的摄取能力,使用盐酸将培养基的pH预先调节至pH 7.4或6.5。然后分别加入使用YOYO-1 (绿色荧光探针)标记的pDNA制备的pH响应纳米粒子(1 mg∙mL-1,150 μL)和非pH响应纳米粒子(1 mg∙mL-1,150 μL),在不同pH(pH 7.4或者pH 6.5)的培养基中与肿瘤细胞共孵育2 h。孵育结束后,PBS (10 mmol∙L-1,2 mL)冲洗三次,每次5 min;然后加入胰蛋白酶(0.25 mg∙mL-1,0.5 mL) 37 ℃消化3 min,消化液离心(800 rpm) 5 min后用PBS (500 μL)重悬;最后使用流式细胞仪分析实验结果。

2.5 细胞转染实验

将MDA-MB-231细胞以每孔10000个细胞的密度接种到24孔板中,并在含10%体积胎牛血清(FBS)的0.5 mL DMEM中培养过夜。为了检测pH响应纳米粒子在不同pH条件下的转染能力,预先使用盐酸将培养基(不含FBS的培养基或者含10% FBS的培养基)的pH调节至pH 7.4或6.5。转染前,将培养基替换为不同pH (pH 7.4或6.5)的新鲜培养基(不含FBS的培养基或者含10%FBS的培养基),将pH响应纳米粒子(0.5 mg∙mL-1,50 μL)和非pH响应纳米粒子(0.5 mg∙mL-1,50 μL)加入到孔板中与细胞共培养。孵育4 h后,将培养基换成0.5 mL含10%体积FBS的新鲜培养基,继续培养48 h。使用PEI25K/pDNA复合物作为阳性对照进行相同处理。实验结束时,将细胞用PBS冲洗。通过荧光显微镜检测tdTomato荧光蛋白的表达并拍照。

3 结果与讨论

3.1 pH响应型高分子的合成与pH响应性

按上述过程合成mPEG113-b-PLys100、mPEG113-b-PLys100/DMMA和mPEG113-b-PLys100/SA后,将合成产物溶解在氘代水中,使用核磁共振谱仪进行表征。如图 3A所示,峰b对应mPEG113-b-PLys100中PEG两个亚甲基上的4个H,峰c对应mPEG113-b-PLys100中赖氨酸次甲基上的一个H,根据峰b和峰c面积比值即可算出赖氨酸的聚合度。对mPEG113-b-PLys100的侧链进行DMMA和SA修饰后,可以根据核磁谱图的变化来确定修饰结果。如图 3B所示,峰f对应mPEG113-b-PLys100/DMMA中DMMA上两个甲基上的6个H,由此可以确定mPEG113-b-PLys100/DMMA的成功合成。同理,在图 3C中,峰f对应mPEG113-b-PLys100/SA中SA上两个次甲基上的4个H,表明了mPEG113-b-PLys100/SA的成功合成。

图3

图3   mPEG113-b-PLys100、mPEG113-b-PLys100/DMMA和mPEG113-b-PLys100/SA的核磁共振氢谱


为了表征mPEG113-b-PLys100/DMMA的pH响应性,将mPEG113-b-PLys100/DMMA溶解在不同pH的氘代磷酸缓冲液中(100 mmol∙L-1,pH 7.4或pH 6.5)并孵育2 h,然后使用核磁共振谱仪进行表征。如图 4A所示,Ha峰和Hb峰分别对应与酰胺键和氨基相邻的亚甲基上两个H的特征峰,mPEG113-b-PLys100/SA在pH 7.4和pH 6.5的条件下孵育2 h后核磁谱图没有发生变化。但是,mPEG113-b-PLys100/DMMA在pH 6.5的环境下孵育2 h后,Hb峰的面积的明显大于Ha峰的面积,说明mPEG113-b-PLys100/DMMA在酸性环境中发生水解导致DMMA基团发生解离。

图4

图4   mPEG113-b-PLys100/SA (A)和mPEG113-b-PLys100/DMMA (B)在不同pH下的核磁共振氢谱


3.2 pH响应纳米粒子的制备与pH响应性

pH响应纳米粒子具有核-壳结构,内核是由pDNA和PEI25K形成的正电性复合物,外壳是pH响应性聚合物mPEG113-b-PLys100/DMMA。为了更好地验证pH响应纳米粒子的pH响应性,通过相同的方法使用非pH响应性聚合物mPEG113-b-PLys100/SA制备非pH响应纳米粒子作为对照组。随后,使用动态光散射和透射电镜对纳米粒子进行了表征。如图 5A图 5B所示,pH响应纳米粒子和非pH响应纳米粒子的为粒径大约130 nm的球形纳米颗粒。

图5

图5   pH响应纳米粒子(A)和非pH响应纳米粒子(B)的动态光散射和电镜数据(标尺:100 nm)


图 4中结果表明mPEG113-b-PLys100/DMMA在酸性(pH 6.5)环境中会发生水解,导致含羧基的DMMA基团的解离,从而暴露出大量的氨基使mPEG113-b-PLys100/DMMA由负电性聚合物转换为正电性聚合物。因此,由mPEG113-b-PLys100/DMMA构成的pH响应纳米粒子在酸性环境中会由于电荷排斥作用脱除表面的聚合物壳层,暴露出正电性的内核。如图 6A所示,pH响应纳米粒子在pH 6.5的环境中,表面电荷发生了明显的转变,由-12.5 mV变为10.4 mV。而由非pH响应型的mPEG113-b-PLys100/SA形成的纳米粒子则不存在表面电荷的转变。这种微环境引发的聚合物壳层脱除,使得pH响应纳米粒子在血液循环过程中拥有PEG化的外层以及负电性的表面电位,利于在血液循环中保持稳定。当纳米粒子进入肿瘤组织后,其PEG壳层在肿瘤微环境中微酸性的刺激下脱除并暴露出正电性的内核,有利于pDNA在肿瘤组织中的富集以及被肿瘤细胞摄取。为了验证pH响应纳米粒子在正常生理环境中的稳定性,我们测试了pH响应纳米粒子在不同pH的PBS (含有10% FBS)中粒径的变化。如图 6B所示,在pH 7.4条件下,pH响应纳米粒子的粒径无明显变化,表现出良好的稳定性。但是在pH 6.5条件下,pH响应纳米粒子的粒径显著增大,这是由于pH响应纳米粒子在酸性环境下脱除PEG壳层暴露出正电性的内核,其与蛋白间的非特异性吸附引起纳米离子和血清蛋白之间的团聚。

图6

图6   (A) pH响应纳米粒子和非pH响应纳米粒子在不同pH条件下的Zeta电位;(B) pH响应纳米粒子在不同pH含有10% FBS的PBS中粒径的变化


3.3 肿瘤细胞对pH响应性纳米粒子的摄取

为了测试肿瘤细胞在不同pH条件下对pH响应纳米粒子的摄取情况,将YOYO-1 (绿色荧光探针)标记的pH响应纳米粒子在不同pH条件下与MDA-MB-231细胞共同培养2 h,随后使用激光共聚焦显微镜对其进行观察。YOYO-1标记的非pH响应纳米粒子进行相同处理作为对照组。如图 7A所示,与在pH 7.4环境中培养相比,在pH 6.5的环境中肿瘤细胞对pH响应纳米粒子的摄取明显增强,这是由于在酸性环境中pH响应纳米粒子可以脱除表面PEG壳层并暴露出正电性的内核,促进了细胞对纳米粒子的内吞作用。但是,肿瘤细胞在不同pH条件下对非pH响应纳米粒子的摄取则没有表现出明显的差异,这是由于该纳米粒子在不同pH环境中均呈现PEG包裹的负电表面,不利于细胞对纳米粒子的内吞作用。流式细胞术的分析结果(图 7B7C)同样验证了这些结论。

图7

图7   肿瘤细胞对在pH条件下对pH响应纳米粒子的摄取

(A) 肿瘤细胞在不同pH条件下对pH响应纳米粒子和非pH响应纳米粒子摄取的激光共聚图片(标尺:20 μm);(B) 肿瘤细胞在不同pH条件下对pH响应纳米粒子和非pH响应纳米粒子摄取的流式细胞术分析;(C) 流式细胞术结果的细胞荧光强度定量分析


3.4 pH响应纳米粒子对肿瘤细胞的转染

为了检测pH响应纳米粒子在不同pH条件下对肿瘤细胞的转染能力,使用编码tdTomato荧光蛋白的pDNA制备pH响应纳米粒子和非pH响应纳米粒子并与MDA-MB-231细胞共同培养,随后使用荧光显微镜观察tdTomato荧光蛋白的表达情况。如图 8所示,与在pH 7.4环境使用pH响应纳米粒子处理的肿瘤细胞相比,在pH 6.5的环境中使用pH响应纳米粒子处理的肿瘤细胞中观察到更强的荧光蛋白表达。但是,在两种pH条件下使用非pH响应纳米粒子处理肿瘤细胞都只能观察到较弱的荧光蛋白表达,这与细胞摄取的结果一致。更重要的是,在转染过程中加入10%的FBS并没有影响pH响应纳米粒子对肿瘤细胞的转染,表明了pH响应纳米粒子在体内实现基因转染的潜力。

图8

图8   pH响应纳米粒子和非pH响应纳米粒子对肿瘤细胞的转染(标尺:50 μm)


4 实验内容拓展

本实验可以根据实验课时以及实验条件的变化进行拓展,包括以下内容:

(1) 使用具有抑制肿瘤细胞增殖功能的pDNA制备pH响应纳米粒子,并验证其在不同pH条件下对肿瘤细胞增殖的抑制效果;

(2) 使用荧光探针标记pH响应纳米粒子并通过尾静脉注射入荷瘤小鼠体内,通过小动物活体成像系统观察纳米粒子在肿瘤部位的富集效果;

(3) 荷瘤小鼠通过尾静脉注射负载抑制肿瘤细胞增殖功能的pDNA的pH响应纳米粒子验证其在体内抑制肿瘤生长的效果。

5 教学方法和实验注意事项

本实验涉及内容较多,内容涉及多个不同的学科。其中纳米粒子表征方法、纳米粒子基因转染效率的评估方面,本文给出了不同的实验方法,在具体教学时可根据课时数量、相关设备保障情况、以及参与课程学生的学科背景和基础进行灵活调整。本实验建议每位教师指导13–15位学生,并将学生以4–5人分为一组进行实验。建议本实验分6周完成,总学时设定为36学时。学生需要在实验之前分组进行文献调研。在第一周的6个学时中,先进行3–4个学时的背景知识讨论,分享学习纳米医学的最新进展以及热点问题。剩余的2–3个学时讨论确定pH响应性聚合物的合成方案以及实验注意事项。由于pH响应性聚合物具有多种合成路线和方法,具体方案可根据实际条件决定,也可为不同组学生安排不同的合成路线进行对比和讨论,本文提供的方案是可选方案之一。第二周的6个学时合成pH响应性聚合物,对于长时间的反应,学生可在课上时间架设反应,经任课教师检查确保无误后,可由小组内学生在课余时间轮流看管,反应结束后的透析提纯和冷冻干燥处理过程同样需要较长的时间,可安排学生轮流到实验室进行换透析液、取冻干样品等操作。第三周对所合成的pH响应性聚合物进行核磁表征并研究其pH响应性能。第四周制备和表征pH响应纳米粒子,本周实验中如有条件安排利用TEM对纳米离子形貌进行观察,建议增加课时。第五周主要学习细胞实验基本操作,并明确相关注意事项。同时本周实验中应指导和确保学生制备好用于细胞实验的纳米粒子,供下周实验使用。第六周将利用肿瘤细胞对所制备的pH响应纳米粒子的细胞摄取能力和转染能力进行研究。这里可根据实验室所具有的条件,使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪观察和分析肿瘤细胞在不同pH条件下对pH响应纳米粒子的摄取和基因转染情况。本周实验可安排同组学生分别采用共聚焦显微镜和流式细胞分析的方法,并引导学生就两种方法的优缺点进行讨论。如果希望每位学生两种方式都进行,则需要适当增加课时。最终实验报告要求以论文形式提交,内容包括背景介绍、实验材料与方法、实验结果与讨论、实验总结等。

实验注意事项:(1) 本实验中所用的三光气、氢溴酸、三氟乙酸有毒性或较强的腐蚀性,必须在通风橱中取用并做好防护措施;(2) 合成mPEG113-b-PLys100中所用的二甲基甲酰胺必须是超干溶剂,否则会降低嵌段聚合物的聚合度;(3) 用于细胞转染实验的pH响应纳米粒子在与细胞共培养前需使用针式过滤器(Φ = 0.45 μm)除菌,避免细胞染菌影响转染效率。

6 结语

随着纳米技术的持续发展和对肿瘤微环境了解的不断深入,基于肿瘤微环境设计的响应性纳米药物递送系统已经成为纳米医学的热点问题。这种环境响应性纳米药物递送系统在正常生理环境下具有良好的稳定性,到达肿瘤组织后受到肿瘤微环境刺激载体性能(包括表面电势、亲疏水性、尺寸等)发生改变,实现药物在肿瘤组织高效、准确地富集,提升药物治疗效果,同时降低对正常组织的影响,减轻药物的副作用。这一类纳米载体的设计,其关键问题在于肿瘤微环境特异性生物信号的选取,以及与之对应的刺激响应性高分子材料的设计与合成。目前,较为常用的肿瘤微环境特征性生物信号包括较低的pH、较高的氧化自由基浓度、特定酶(如金属蛋白酶-2等)表达量的上调等,这些生物信号均可以被用作区别肿瘤组织与正常组织的生物信号,其合理识别和利用将有利于提高纳米药物递送载体的肿瘤特异性。本实验以识别肿瘤微环境酸性为例,展示了一种pH响应纳米粒子的制备方法,并利用该纳米离子实现了对质粒DNA的高效胞内递送。实验设计面向以化学为基础的前沿交叉学科,将当前高分子化学与材料中最新的科研成果“返哺”于实验教学,传授和训练学生高分子化学与生物医用材料相关基本实验技能的同时,使学生可以直观地了解到当前高分子化学的前沿研究领域,掌握相关的基本研究方法和研究思路,有效填补当前实验教学与科学研究之间的空白,增强学生对于从事相关领域研究工作的自信心。同时,本实验设计以聚合物化学合成为基础,逐步引导学生利用所合成聚合物通过自组装的方法构建纳米粒子,并引入多种测试表征手段对聚合物及纳米粒子的理化性质和生物行为进行研究和表征,内容丰富,并使学生有机会接触NMR、激光光散射、TEM、荧光显微镜等大型仪器,使学生可以直观地了解到自己所合成材料的性质和功能,提升学生对于相关研究的兴趣。最后,通过对测试结果的分析讨论,可以使学生认识到高分子材料结构和性能之间的联系,从而建立对聚合物材料理性设计更为深刻的认识。本综合实验可使学生体验科学研究的具体过程,可有效引导学生完成从本科阶段的课程学习到科学研究创造的转换。

参考文献

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URL     [本文引用: 1]

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