大学化学, 2021, 36(8): 2011032-0 doi: 10.3866/PKU.DXHX202011032

化学实验

基于半导体聚合物纳米粒子探针的比率型活性物种检测——推荐一个研究型综合化学实验

宋国胜,, 廖师夷, 王友娟, 宦双燕,

Semiconducting Polymer Nanoprobe for Ratiometric Detection of Reactive Oxygen Species: A Comprehensive Experiment

Song Guosheng,, Liao Shiyi, Wang Youjuan, Huan Shuangyan,

通讯作者: Email: songgs@hnu.edu.cn (宋国胜)Email: syhuan@hnu.edu.cn (宦双燕)

收稿日期: 2020-11-9   接受日期: 2020-12-23  

基金资助: 国家自然科学基金.  21804039
2020年湖南省普通高等学校课程思政建设研究项目.  HNKCSZ-2020-0074

Received: 2020-11-9   Accepted: 2020-12-23  

Abstract

This works introduces a comprehensive research experiment about the synthesis and characterization of nanoprobes for detecting reactive oxygen species (ROS). In this experiment, organic semiconducting polymer nanoprobes were prepared using nano-coprecipitation method. Those nanoprobes can be employed for ratiometric detection of ROS, using semiconductor polymer (PFODBT) as the reference and fluorescent molecules (IR775s) as responsive unit. Specifically, the content of ROS (ClO- and ONOO-) can be measured by calculating PFODBT-to-IR775s absorbance ratio. Moreover, based on the principle of fluorescence resonance energy transfer (FRET) between PFODBT and IR775s, the ratio of fluorescent emission of PFODBT/IR775s can also be used for fluorescence ratiometric detection of ROS. This experiment is comprehensive and feasible, and benefited for training the solid experimental skills and scientific research ability for students.

Keywords: Analytical measurement ; Nanoprobe ; Fluorescence resonance energy transfer ; Ratiometric detection ; Reactive oxygen species

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宋国胜, 廖师夷, 王友娟, 宦双燕. 基于半导体聚合物纳米粒子探针的比率型活性物种检测——推荐一个研究型综合化学实验. 大学化学[J], 2021, 36(8): 2011032-0 doi:10.3866/PKU.DXHX202011032

Song Guosheng. Semiconducting Polymer Nanoprobe for Ratiometric Detection of Reactive Oxygen Species: A Comprehensive Experiment. University Chemistry[J], 2021, 36(8): 2011032-0 doi:10.3866/PKU.DXHX202011032

半导体聚合物纳米粒子(Semiconducting Polymer Nanoparticles,SPNs)是由疏水性半导体聚合物通过纳米组装的方法制备,并能直接分散在水溶液中的一种新型纳米材料[1, 2]。SPNs本身的特殊分子结构使其具有优异的光学性能,并具有高生物相容性和可降解性的特点,能够很好地克服无机量子点中普遍存在的体内长期滞留和生物毒性等问题[3, 4]。因而,SPNs在生物标志物的检测上具有极大的优势和潜力。

活性氧物种(Reactive Oxygen Species,ROS)是指机体内或者自然环境中含氧并且性质活泼的物质的总称。常见的ROS包括H2O21O2、HClO、·OH、ONOO-等等[5-7]。生物体内ROS的正常水平对维持体内的氧化还原动态平衡起着重要作用。在外源刺激(如紫外线或X射线)的刺激下,ROS会剧烈产生,导致机体的氧化还原平衡失调[8, 9],进而发生一系列疾病,如癌症、动脉粥样硬化、心脑血栓等[10]。因此,高灵敏地检测生物体内ROS的含量变化对于进一步了解其生理功能和准确诊断ROS相关疾病具有重要意义。

传统单信号输出的检测方法易受到检测过程中环境因素的干扰。与之相比,通过多信号输出的比率型检测方法,可使用多种不同信号相互参照,提高检测的准确度,进而有望消除因探针浓度、光漂白、检测设备等因素所造成的数据失真。因此,该方法在细胞和动物活体水平进行目标物检测方面有着广泛应用前景。

本实验基于半导体聚合物(PFODBT)对ROS的高稳定性,将PFODBT作为信号参考分子,利用染料分子(IR775s)对ROS响应性变化的特性;将IR775s作为响应分子,并通过纳米共沉淀法制备了有机聚合物纳米探针(SPNs)。该纳米探针通过比率型吸光度和比率型荧光的方法,实现对溶液中的ROS(ClO-和ONOO-)的高灵敏检测。学生在应用光谱分析方法进行活性氧物种的检测实验中,不仅可以掌握紫外-可见吸收光谱仪和荧光光谱仪的使用方法和原理,而且锻炼了分析和处理数据的能力,能够引导学生养成勤于思考的习惯,并激发学生的创新能力。

1 实验目的

1) 掌握纳米共沉淀法制备有机纳米粒子的原理、方法及表征手段。

2) 了解比率型吸光度和荧光检测方法的基本原理、优势及在分析检测中的应用。

3) 了解紫外-可见吸收光谱仪和荧光光谱仪的结构和测量原理,掌握仪器基本操作方法。

4) 学会使用分析软件处理和分析实验数据(比率型计算以及检测限计算方法)。

2 实验原理

2.1 纳米共沉淀法制备有机纳米粒子的原理

图 1所示,本实验中使用有机半导体聚合物分子(聚[2, 7-(9, 9-二辛基芴)-alt-4, 7-双(噻吩-2-基)苯并-2, 1, 3-噻二唑],简称PFODBT)、荧光染料分子(2-[2-[2-(β-羧乙硫基)-3-[2-(1, 3-二氢-1, 3, 3-三甲基-2H-吲哚-2-亚烷基)-亚乙基-]-1-环己烯-1-基]-1, 3, 3-三甲基-3H-吲哚鎓,简称IR775s)和表面活性剂(Pluronic F127,简称F127)通过疏水-疏水相互作用,自组装形成纳米粒子(PFODBT-IR775s)。

图1

图1   纳米颗粒合成原理示意图


2.2 比率型吸光度法的检测原理

根据现有文献报道,低浓度的ROS(ClO-/ONOO-)可选择性地破坏IR775s分子结构,显著降低IR775s的特征吸收峰和荧光强度[11, 12]。然而,PFODBT对低浓度的ROS是相对稳定的。通过纳米共沉淀法将PFODBT和IR775s自组装成纳米粒子后,PFODBT-IR775s纳米探针同时具有两者的特征吸收峰。IR775s的特征吸收峰(775 nm)作为响应信号,而PFODBT的特征吸收峰(550 nm)作为参考信号。随着溶液中ROS的浓度加大,IR775s逐渐被破坏,775 nm处的吸收峰降低;同时PFODBT的特征吸收峰(550 nm)保持不变。根据两处的吸光度的比值(A550/A775)的变化,实现对ROS的比率型吸光度检测(图 2)。

图2

图2   有机纳米探针比率型吸光度法检测ROS示意图


2.3 比率型荧光法的检测原理

荧光能量共振转移(FRET)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当两个荧光分子的距离在10 nm以内,并且供体分子的发射光谱与受体分子的吸收光谱重叠时,两者可产生FRET,使得供体的荧光强度降低,而受体发射的荧光强度增强[13]。在纳米探针PFODBT-IR775s中,由于PFODBT的荧光发射波长与IR775s的吸收波长相匹配,PFODBT的荧光能量转移给IR775s,PFODBT的荧光发射强度(695 nm)将会降低。当ROS(ClO-/ONOO-)破坏IR775s后,PFODBT与IR775s之间的FRET效应减弱,导致IR775s荧光(825 nm)的降低和PFODBT荧光(695 nm)的恢复。根据695 nm和825 nm处的荧光强度比值(F695/F825)变化,从而实现对ROS的比率型荧光检测(图 3)。

图3

图3   有机纳米探针比率型荧光法检测ROS示意图


3 试剂与仪器

3.1 实验试剂

聚[2, 7-(9, 9-二辛基芴)-alt-4, 7-双(噻吩-2-基)苯并-2, 1, 3-噻二唑] (PFODBT),2-[2-[2-氯-3-[2-(1, 3-二氢-1, 3, 3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)-亚乙基]-1-环己烯-1-基]-乙烯基]-1, 3, 3-三甲基-3H-吲哚鎓氯化物(IR775Cl),Pluronic F127 (F127)购于Sigma-Aldrich。3-巯基丙酸购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。二甲亚砜(DMSO)、三乙胺、无水Na2SO4、2-丙醇、二氯甲烷(CH2 Cl2)、四氢呋喃(THF)、NaClO溶液、NaCl、NaNO2、HCl、H2O2、NaOH购于国药集团化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯。NaClO溶液和ONOO-溶液需现配现用,IR775s按文献方法[12]合成。

3.2 实验仪器

50 mL圆底烧瓶、血清瓶(5 mL、50 mL)、100 KD MWCO超滤管。其他大型仪器见表 1

表1   实验仪器

仪器名称型号生产厂家
紫外-可见吸收光谱仪UV-2450Shimadzu (日本)
荧光光谱仪Fluoromax-4Jobin Yvon (法国)
高速离心机H2050R湖南湘仪实验室仪器开发有限公司
旋转蒸发仪RE301郑州科达机械仪器设备公司
透射电子显微镜F2100日本电子株式会社生产
超声波清洗仪KM5200DE昆山美美超声仪器有限公司

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4 实验步骤

4.1 IR775s的合成

将IR775Cl (519.55 mg,1.0 mmol),3-巯基丙酸(265 μL,3.0 mmol)和三乙胺(425 μL,3.0 mmol)依次加入到10 mL的DMSO (二甲亚砜)溶液中,之后在室温条件下将混合溶液搅拌20 h。然后,加入二氯甲烷,并用氯化钠饱和溶液洗涤整个混合液系统,分液后得到有机相。再将有机相经无水Na2SO4干燥,过滤并通过旋转蒸发仪浓缩,获得IR775s粗产物。最后,粗产物用硅胶柱色谱法纯化(CH2Cl2/MeOH,体积比10 : 1),得到绿色固体收集在离心管中,常温避光储存。图 4考虑到该部分时间较长,IR775s可由实验教师提前制备。

图4

图4   合成染料分子IR775s的反应原理图


4.2 IR775s水溶液的配制

在分析天平上准确称取1 mg的IR775s固体于1.5 mL离心管中,加入1 mL DMSO,配成1 mg·mL-1的溶液。然后,取10 μL的IR775s/DMSO溶液,加至装有90 μL超纯水的1.5 mL离心管中,配成100 μg·mL-1的IR775s水溶液。用锡箔纸包封好离心管,放置于4 ℃冰箱待用。

4.3 ROS溶液的配制

ONOO-溶液根据文献报道配制[14]。为了配制ONOO-溶液,将5 mL的NaNO2溶液(0.6 mol·L-1)与350 μL的H2O2溶液(0.7 mol·L-1)混合,随后在搅拌下加入250 μL的HCl溶液(0.6 mol·L-1)预酸化。再将上述溶液快速加入到10 mL的NaOH (1.5 mol·L-1)溶液中,混合均匀。进一步添加80 mg的MnO2除去过量的H2O2。最后,使用0.2 μm过滤器过滤溶液。所制备的ONOO-溶液,保存在-20 ℃下备用。使用前,通过紫外-可见光谱仪测定ONOO-溶液的吸光度,并计算浓度(A = εbcε302 nm = 1670 L·mol-1·cm-1b= 1 cm)。

为了配制ClO-溶液,取58 μL NaClO溶液母液加入到4942 μL超纯水中,得到浓度为10 mmol·L-1的ClO-溶液。

4.4 制备有机纳米粒子(SPNs)

有机纳米粒子按文献报道过的方法合成[2]。首先,将PFODBT、IR775s、5 mg F127溶于1 mL THF中,在超声条件下将其混匀(1-3 min),然后将混合溶液快速注入到9 mL的超纯水中(保持超声状态),并继续超声8-10 min。之后,关闭超声,停止反应,将超声混合后的溶液转移到50 mL的圆底旋蒸瓶中,在45 ℃下旋蒸10 min (转速100 r·min-1)至烧瓶中不再产生明显气泡。最后,将溶液加入到100 KD超滤管中,超滤清洗三次,放置在4 ℃冰箱中,待用。其中,为了制备PFODBT纳米粒子,将100 μg的PFODBT纳米颗粒和5 mg的F127溶于1 mL THF中;为了制备PFODBT-IR775s纳米粒子,将128 μg的PFODBT、384 μg的IR775s和5 mg的F127溶解于1 mL THF中。

4.5 透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)表征

TEM样品的制备:用移液枪吸取SPNs溶液,滴在一个干净平滑的铜网片表面,使铜网片均匀的布满一层润滑的样品溶液,在红外灯照射下干燥铜网,直至铜网片表面的溶液完全干燥,再使用TEM进行观察。

动态光散射制样:将4 μL的100 μg·mL-1 SPNs分散在1 mL的超纯水中,超声8-10 min。

4.6 比率型检测溶液中ROS

为了检验纳米探针的可行性,我们首先测试了IR775s水溶液和PFODBT纳米颗粒分别对ROS的响应。

检测ClO-:将20 μL的SPNs (100 μg·mL-1)分别与0-24 μL 2 mmol·L-1 ClO-溶液混合,之后通过PBS缓冲液(pH = 7.4)补齐至250 μL,室温下反应30 min后,分别测定这些溶液的紫外-可见光谱和荧光光谱。

检测ONOO-:将20 μL的SPNs (100 μg·mL-1)分别与0-96 μL 500 μmol·L-1 ONOO-溶液混合,之后通过PBS缓冲液(pH = 7.4)补齐至250 μL,室温下反应30 min后,分别测定这些溶液的紫外-可见光谱和荧光光谱。

4.7 实验过程中的注意事项

1) 纳米探针在合成以及长期储存时,需要避光,避免探针分子分解;

2) 由于使用某些有机溶剂,实验操作需要在通风条件下进行;

3) 除去四氢呋喃时,旋转蒸发时间应在10 min以上,以尽量除净四氢呋喃。

5 结果与讨论

5.1 染料分子IR775s的表征

将制备得到的IR775s固体溶于二氯甲烷中,注入电喷雾电离质谱仪。从质谱图中可看出(图 5),主峰为m/z= 607.3,与IR775s分子量相同,证明所得产物与目标产物一致。所合成IR775s的最大吸收峰在775 nm处(图 6a),荧光发射峰在850 nm处(图 6b)。

图5

图5   染料分子IR775s的质谱图


图6

图6   染料分子IR775s的紫外-可见光谱(a)以及荧光光谱(b)


5.2 有机纳米粒子的表征

PFODBT-IR775s纳米粒子具有良好的水溶性,其水溶液呈紫红色,如图 7a所示。动态光散射(DLS)测量表明,PFODBT-IR775s纳米粒子的平均水动力直径为68 nm (如图 7b所示)。如图 7c所示的透射电子显微镜(TEM)结果表明,该纳米粒子具有球形形貌。

图7

图7   PFODBT-IR775s纳米粒子表征

(a) 实物图;(b) DLS;(c) TEM   电子版为彩图


5.3 可行性探究

图 8a图 8b紫外-可见光谱所示,随着ROS (ClO-或ONOO-)浓度的增加,IR775s水溶液的特征吸收峰(775 nm)逐渐下降,说明IR775s易被ROS破坏。如图 8c图 8d紫外-可见光谱所示,当ClO-或ONOO-浓度升高时,PFODBT的特征吸收度峰(550 nm)几乎保持不变,说明PFODBT对于ClO-和ONOO-都是稳定的。PFODBT和IR775s对ClO-或ONOO-的不同响应特性,为开发比率型检测ClO-或ONOO-的纳米探针奠定了基础。

图8

图8   (a) IR775s染料分子对ClO-的吸收光谱图;(b) IR775s染料分子对ONOO-的吸收光谱图; (c) PFODBT纳米粒子对ClO-的吸收光谱图;(d) PFODBT纳米粒子对ONOO-的吸收光谱图


5.4 纳米探针比率型检测ClO-

图 9a吸收光谱所示,在没有加入ClO-时,PFODBT-IR775s纳米探针具有PFODBT和IR775s的特征吸收峰,说明成功合成了该纳米粒子。随着ClO-浓度的增强,IR775s的特征吸收峰(775 nm)的强度显著降低,而PFODBT的特征吸收峰(550 nm)基本保持不变。根据图 9a,计算出吸光度在550 nm和775 nm的两处信号的比值(A550/A775),并绘制出A550/A775与ClO-溶液浓度的关系曲线。如图 9b所示,随ClO-溶液浓度的增强,A550/A775逐渐增加。因此,基于这种比率型吸光度的变化可实现对ClO-检测。

图9

图9   (a) 纳米探针PFODBT-IR775s对不同浓度ClO-的吸收光谱图;(b) 吸光度比值(A550/A775)与ClO-溶液浓度的关系曲线;(c) 纳米探针PFODBT-IR775s对不同浓度ClO-的荧光光谱图;(d) 荧光强度比值(F695/F825)与ClO-溶液浓度的关系曲线


图 9c荧光光谱所示,在没有加入ClO-时,PFODBT-IR775s纳米探针在695 nm处的荧光发射峰较弱,说明PFODBT-IR775s之间存在较强的FRET效应。随着ClO-浓度的增大,PFODBT-IR775s纳米探针在825 nm处的荧光发射峰下降,而在695 nm处的荧光发射峰显著上升。该现象说明ClO-可以逐渐破坏IR775s,导致PFODBT-IR775s之间的FRET效应降低,从而PFODBT在695 nm处的荧光强度逐渐恢复。根据图 9c,计算出荧光在695 nm和825 nm的两处信号强度的比值(F695/F825),并绘制出F695/F825与ClO-溶液浓度的关系曲线。如图 9d所示,随ClO-溶液浓度的增强,F695/F825逐渐增加。通过拟合获得线性方程(y= 0.29x + 0.874)。相关性(R2= 0.946)说明在该浓度范围内,纳米探针的荧光强度的比率(F695/F825)与ClO-浓度呈良好的线性关系。并且根据公式可计算出该检测方法的检测限LOD = 3σ/k = 0.79 μmol·L-1。因此,基于这种比率型荧光变化可实现对ClO-检测。

5.5 比率型检测ONOO-

根据图 10a,计算出吸光度在550 nm和775 nm的两处信号的比值(A550/A775),并绘制出A550/A775与ONOO-溶液浓度的关系曲线。如图 10b所示,通过拟合获得线性方程(y= 0.24x + 2.071)。相关性(R2= 0.991),并且根据公式可以计算出该检测方法的检测限LOD = 3σ/k = 1.59 μmol·L-1

图10

图10   (a) 纳米探针PFODBT-IR775s对不同浓度ONOO-的吸收光谱图;(b) 吸光度比值(A550/A775)与ONOO-溶液浓度的线性关系曲线;(c) 纳米探针PFODBT-IR775s对不同浓度ONOO-的荧光光谱图;(d) 荧光强度比值(F695/F825)与ONOO-溶液浓度的线性关系曲线


根据图 10c,计算出荧光在695 nm和825 nm的两处信号强度的比值(F695/F825),并绘制出F695/F825与ONOO-溶液浓度的关系曲线。如图 10d所示,通过拟合获得线性方程(y= 0.038x + 1.169)。相关性(R2= 0.995),并且根据公式可计算出该检测方法的检测限LOD = 3σ/k = 13.2 μmol·L-1

6 实验教学特点

本实验内容紧密结合学科前沿,综合运用多种方法原理、实验技术和仪器设备,能够使学生所学的知识融会贯通,同时培养学生的科研兴趣。具有如下特点:

(1) 有机半导体聚合物纳米粒子的制备属于常温反应,产率高,条件易于控制。反应时长对纳米粒子形貌和性质影响不大,实验重复性好。如果IR775s提前合成好,纳米粒子的制备部分可在30分钟内完成,符合本科生实验学时的设计要求。

(2) 有机纳米粒子检测ROS的能力受到多种因素的影响,如投料比例、反应物浓度、表面活性剂等。因此,可让学生探索不同实验条件,研究其对检测ROS灵敏度的影响,并分析影响规律。

(3) 通过引用荧光共振能量转移原理,促进本科生对光谱分析知识的深入学习。比率型检测是光谱分析中消除环境因素干扰的一种常用方法。在本实验中,可将比率型检测结果与单信号检测结果进行对比,凸显使用比率检测的优势。

(4) 本实验中涉及多种实验技术的综合运用:IR775s的合成和表征既可放在实验内,也可以提前准备好;纳米粒子的形貌尺寸表征运用到动态光散射、透射电子显微镜的使用;光谱性能测试运用到紫外-可见光吸收谱仪和荧光光谱仪。

(5) 本实验成功率高,可实施性强;既有敏感条件又有不敏感条件,通过学生对实验条件的探索,培养实验设计能力;通过完整的数据分析,提高学生实验数据处理能力。实验涉及大型仪器综合使用,有利于扩展本科生视野,促进学生探究潜质的开发。本实验所合成的纳米粒子探针还可以进一步扩展到光谱分析的前沿领域,如在活体水平监测活性氧的含量。

7 思考题

(1) 比率型检测有哪些优势?

(2) 什么是荧光共振能量转移?

(3) PFODBT/IR775s的投料比对探针特性如灵敏度有什么影响?

(4) 聚合物纳米粒子探针用于光谱检测,有哪些优点?

8 教学组织运行方式和教学方法

(1) 实验学时安排和运行方式。

建议实验分两个阶段进行:第一阶段纳米粒子的合成和表征;第二阶段纳米粒子检测活性氧物质的测试。两个阶段共需约8 h (4 h + 4 h)。一堂实验课中参与实验的学生人数为10-15人,每人制取一个样品。

(2) 线上线下混合式教学方法。

实验课提前录制好课程指导性短视频,放到MOOC平台或课程中心网站上,学生实验前线上预习,了解实验中应注意的问题,熟悉使用到的仪器设备原理、构造和操作技巧,完成预习的小练习。教师对学生的预习报告和提出的综合设计方案进行指导,引导学生思考可能引起探针性质变化的几种因素,并列出可能具体的实验方案。如:

① 通过改变IR775s与PFODBT的掺杂比例(1 : 2/1 : 3/1 : 5),研究掺杂比例对纳米探针灵敏度的影响;

② 通过改变表面活性剂的量(2.5 mg/5 mg/7.5 mg),研究表面活性剂的量对纳米探针灵敏度的影响。

③ 通过改变表面活性剂的种类(PSMA/F127/DSPE-PEG),研究表面活性剂的种类对纳米探针灵敏度的影响。

现场实验教学时,注意分组安排实验条件设计,不同实验条件既有平行对比,又有组内和组间对比,通过全体学生的实验结果,获得总的实验规律和结论。实验中注意采用启发式引导,让学生自主思考,培养创新意识。

实验过程中和实验结束后,组织学生进行实验汇报,比较各种投料比例所制备材料的检测灵敏度;有兴趣的学生可参加教师的相关课题研究,并可在开放实验中继续进行探索。根据平时的开放实验结果,又可应用于本科实验教学中,可使该实验的设计内容与时俱进,有较大的开放性。该实验内容已经在本校的本科生SIT (大学生创新训练)项目中进行了多次尝试,实验效果良好。

9 结语

本实验采用纳米共沉淀法制备了有机半导体聚合物纳米粒子。基于PFODBT对ROS的高稳定性,将PFODBT作为信号参考分子;利用IR775s对ROS响应性变化的特性,将IR775s作为响应分子。该纳米探针通过比率型吸光度和比率型荧光的方法,实现对溶液中的ROS (ClO-和ONOO-)的准确检测。作为实验课程教学,本实验在方法上引入了光谱分析中荧光共振能量转移原理和比率型检测方法,使本科生了解比率型检测方法对于单信号检测方法的优势,拓展了学生的能力;完整的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱测试训练提升了学生使用基本光谱分析仪器的能力。比率型检测以及检测限的计算过程有利于训练本科生的实验数据处理能力,培养学生分析化学思维能力。灵活的实验设计方案也能进一步激发学生的研究兴趣,培养了学生的探索精神。该方法操作方便、可行性高,有利于培养学生的实验技能和科研能力。

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