大学化学, 2022, 37(3): 2111002-0 doi: 10.3866/PKU.DXHX202111002

今日化学

从生物矿化到仿生矿化:构筑新功能生命体

周玥旻1, 王晓雨,2, 唐睿康,1,2

1 浙江大学化学系,杭州 310027

2 浙江大学求是高等研究院,杭州 310027

From Biological to Biomimetic Mineralization: Construction of New Functional Life Forms

Zhou Yuemin1, Wang Xiaoyu,2, Tang Ruikang,1,2

1 Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China

2 Qiushi Academy for Advanced Studies, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China

通讯作者: Email: xy_wang@zju.edu.cn (王晓雨)Email: rtang@zju.edu.cn (唐睿康)

收稿日期: 2021-11-1   接受日期: 2021-11-29  

基金资助: 国家自然科学基金项目.  21625105
浙江省自然科学基金项目.  LY17B010001

Received: 2021-11-1   Accepted: 2021-11-29  

Abstract

Biomineralization is an important biological process of organisms to produce organic-inorganic composites with hierarchical structures, where the biological matrix plays a predominant role in the regulation of nucleation, orientation, growth, and self-assembly of inorganic materials. According to the principle of biomineralization, bionic organic-inorganic composites with well-defined structure and excellent properties can be thus synthesized under a biomatrix-mediated process. Intriguingly, it is now possible to obtain new functionalized organisms by means of biomimetic mineralization through synergistic integration of structure and function of both materials and organisms, which has become an emerging direction. This review first introduces the basic theory and phenomenon of biological mineralization in nature. Then, by introducing the structure and function of biological minerals, we propose the concept of biomimetic construction of new functional life, and systematically introduce the methods involving the construction of new material-organisms hybrid. On this basis, such biomineralization-based engineering strategy provides a new way to produce materials-organisms hybrids as new life forms, and shows immense potentials in environmental protection, energy, medicine and other fields. Finally, the limitations and problems existing in this field are discussed, and promising prospects of intelligent construction of materials-organisms hybrids are also presented. We believe the biomineralization-based engineering of organisms can promote the continuous fusion of disciplinary boundaries and provide a new development direction in the fields of materials science, chemical biology, bioinorganic chemistry and medicine.

Keywords: Biomineralization ; Organism-material hybrid ; Shell engineering ; Artificial organelle

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周玥旻, 王晓雨, 唐睿康. 从生物矿化到仿生矿化:构筑新功能生命体. 大学化学[J], 2022, 37(3): 2111002-0 doi:10.3866/PKU.DXHX202111002

Zhou Yuemin. From Biological to Biomimetic Mineralization: Construction of New Functional Life Forms. University Chemistry[J], 2022, 37(3): 2111002-0 doi:10.3866/PKU.DXHX202111002

生物矿化作为自然界中普遍存在的现象,是指有机生命体调控无机矿物形成的过程。在生物矿化的过程中有机基质如有机小分子、多肽、蛋白质、核酸等作为矿物的成核位点,在生物环境中诱导晶体的定向生长和自组装,进而产生具有多级有序结构的有机-无机复合结构。在生物体的调控作用下生物矿物通常具有优异的理化特性,比人工合成材料具有更高的硬度、强度和韧性,能够为生物体提供支撑保护、代谢调控等特殊的功能[1]。例如天然贝壳由95%的文石和5%的有机物质组成,其强度和韧性比合成的碳酸钙提高了约3000倍[2];甲壳类昆虫球鼠妇在周期性换壳过程中,降低甲壳中镁离子和天冬氨酸的含量来减缓无定形相到结晶相的转变过程,有效保证了新外壳的复杂结构[3];哺乳动物的骨骼和牙本质是由沿胶原纤维方向生长的羟基磷灰石晶体组成,其多级有序结构保证了自身的韧性和强度[4]。由此可见,在自然进化过程中,生物体根据自身特性和需求获得了对矿物合成的精准调控能力,通过无机矿物与生物体巧妙的组装产生更加优越的性能[5]

受到天然生物矿化的启发,人们提出了仿生矿化的策略。有机基质通过其表面活性官能团能够降低晶体的成核能垒,促进无机矿物的异相成核过程[6],故通过有机基质能够调控无机物结晶动力学过程,实现可控无机矿物的沉积。因此,仿生矿化的策略能够用于模仿自然界中生物矿物的结构,通过合理设计能够合成出结构可控、理化性质优异、生物相容性好的多级有序的复合材料,即实现结构仿生。例如:通过冷冻诱导组装和乙酰化过程得到β-几丁质基质,经Ca(HCO3)2的分解对基质进行矿化,再由丝素蛋白渗透和热压过程即可获得与天然珍珠层的成分和结构高度相似的材料,具有良好的极限强度和断裂韧性的仿生材料[7];对于骨缺损[8]和牙釉质[9]的修复,可通过在修复液中添加蛋白质或多肽实现对羟基磷灰石(HAP)的成核、生长、取向过程的控制,实现晶体的原位再矿化,制备出具有优异机械强度和摩擦性能的无机仿生修复层;Ⅰ型胶原蛋白能够组装成三螺旋结构[10],并诱导磷酸钙在胶原纤维内成核和矿化,实现晶体的定向生长和组装,被广泛用于软骨和牙本质的修复[11]

在进化过程中,精密的生物矿化结构能使生物体获得感光、趋磁、保护等特殊的功能。如趋磁细菌合成磁铁矿晶体作为磁传感器[12];硅藻借助二氧化硅骨架来预防紫外线的辐射和掠食者的捕获[13]。值得注意的是,处于极端环境中的生物通常具有特殊功能的生物矿化结构。例如沙漠地区的微生物通常产生二氧化硅矿化外壳来抵御高温、辐射、干燥的影响[14];火山口附近的多毛类蠕虫体内管道中通常具有较高含量的硫化铁和二氧化硅,其在钙化结构中有利于增强结构刚性和对环境的适应能力[15]。尽管生物矿化结构在不同生物体中表现出许多优异的功能,但许多生物体并不具备自发生物矿化的能力。而通过仿生矿化的方法,将无机结构引入这类生物体中,经材料与生物体的结构整合和功能调控可以产生“新功能生命体”,在保证生物体自身功能的同时,赋予其更多的新特性,即实现功能仿生。与结构仿生不同,功能仿生强调无机矿物的掺杂对生物体功能的改善。例如在鸡蛋壳功能的启发下,病毒经可降解的磷酸钙外壳修饰后能够成为“特洛伊木马”,既能逃避细胞外抗体的清除,还能通过非特异性的内吞途径进入细胞,在酸性条件下脱去外壳恢复感染能力,赋予病毒新的生物医学应用潜力[16]

综上,本文通过阐述生物矿化基本原理和举例说明自然界中生物矿化现象,强调了生物矿化的重要性,提出模拟生物矿化进行结构仿生和功能仿生的策略。在此基础上详细介绍了生物体和功能材料整合的方法,包括自发矿化、界面修饰矿化、胞内矿化和基因工程矿化。随后讨论不同仿生策略下通过病毒、原核生物和真核生物与材料的整合实现的新功能,包括在环境保护、能源化工、生物催化和生物医学等领域的应用。最后,总结仿生矿化领域进展,提出该研究领域的机遇与挑战,对构筑“新功能生命体”的研究前景进行展望。

1 生物矿化

1.1 生物矿化和仿生矿化

早在35亿年前,从原核生物到真核生物,生物体逐渐发展出合成矿物的能力,并通过体内基因调控矿化“程序”的运行,实现对自身新陈代谢过程的调节,以适应环境和生物应力的变化[17]

在生物体中,生物矿化是指生物利用细胞活动来指导矿物沉积的过程[18, 19]。首先,细胞分泌产生矿化相关的有机基质,如聚合物、蛋白质、多糖、胶原等作为模板,为矿化提供成核位点;其次,通过调节环境中阴离子和阳离子的浓度,细胞能够将矿化所需的离子运输到沉积位点,促进成核并生长出复杂的特异性产物。其中阳离子主要通过离子通道主动运输,而阴离子则是通过由阳离子传输过程中产生的pH梯度驱动的被动扩散。受细胞调控形成的生物矿物相通常具有特殊的形貌、尺寸、结晶度和微量元素组成,其中有机组分不仅增强了复合材料的机械性能,还对矿化过程起着至关重要的控制作用,使材料显示出有趣的特性和受控的分级结构,与人工合成的整块无机材料完全不同。

此外,生物矿化结构能够在细胞水平上对外部刺激做出反应,进行自我修复和结构的重塑。例如骨钙素作为骨骼中最丰富的非胶原蛋白,可协调钙矿物的沉积,当出现骨折情况时可招募破骨细胞和成骨细胞进行骨吸收和再沉积[20, 21]。因此,深入研究生物矿化的过程对于了解生物硬组织的形成方式至关重要,为仿生制备类似结构的生物材料提供研究思路[22, 23]。此外,生物矿化的研究还能够解释生理性和病理性矿化的相关疾病的病因,例如骨质疏松[24]、牙釉质修复[25]、心血管疾病[26]、白内障[27]等。

近年来随着生物矿化领域的不断拓展,在生物矿化原理的指导下,研究者们通过模拟生物矿化过程,利用生物大分子的模板效应对无机成核-结晶过程中的反应动力学加以控制,可实现仿生材料的可控合成,构建出性能优异的有机-无机复合材料。唐睿康课题组[28]在鸡蛋壳结构和功能的启发下,首次提出了基于细胞壳工程策略的生物-材料整合概念,在单个细胞表面引入磷酸钙外壳,通过化学修饰实现了细胞的生物功能多样化。如图 1所示,与经典的仿生矿化策略不同,通过仿生矿化策略构筑新型生命体的研究将生物体作为一个整体而不是简单的有机模板[29],突出了利用材料的结构和理化特性来实现对生命体的结构、功能、行为调控的目的,是一种基于化学和材料手段的生物体进化新策略[30]

图1

图1   材料与生物体整合构筑“新功能生命体”[29]


1.2 生物矿物及其功能

生物矿物具有特殊的形貌结构和组装方式,可发挥出特定的功能,如骨架支撑[31]、重力传感[32]、磁场传感[33]等作用。早在寒武纪末期,来自不同种属的生物体就进化出了60多种不同的矿物种类[17],主要由钙、铁、镁、锰、钡等金属离子和阴离子结合形成碳酸盐、磷酸盐、草酸盐、硫酸盐、氧化物、硫化物、硅化物等矿物。

作为生物体内重要的第二信使,钙离子在生物的功能和新陈代谢中起到重要作用,因此钙盐在生物矿物中占主要部分,并主要以碳酸钙和磷酸钙的形式存在[34]

碳酸钙晶体主要包括文石、方解石、球霰石、一水合碳酸钙(CaCO3∙H2O)、六水合碳酸钙(CaCO3∙6H2O) [35]等晶型,并对应着不同的矿物微结构。除了碳酸钙晶体,无定形碳酸钙(ACC)也在生物体内以相对稳定的形式存在于矿物早期形成过程。在发育早期的海胆骨刺针状体中,碳酸钙以ACC的形式大量储存,随着海胆的发育成熟,ACC逐渐转化为方解石[36]

磷酸钙矿物在生物体内主要以无定形磷酸钙(ACP)、羟基磷灰石(HAP,Ca10(PO4)6(OH)2)、磷酸八钙(OCP,Ca8H2(PO4)6)、磷酸三钙(TCP,Ca3(PO4)2)、磷酸氢钙(DCP,CaHPO4)和二水磷酸氢钙(DCPD,CaHPO4∙H2O)等形式存在,其中HAP和TCP是生物体骨骼和牙齿的主要成分,赋予了生物硬组织优异的物理和机械特性[37]。有趣的是,无脊椎动物主要依赖于碳酸钙矿物,而脊椎动物除去以碳酸钙形成的内耳耳石外,几乎只使用磷酸钙。

硅矿物主要存在于硅藻、植物和海绵中。硅藻是单细胞藻类,主要通过从环境中吸收可溶性硅酸在细胞壁上催化纳米二氧化硅(SiO2)形成,不同种类的硅藻细胞壁具有从纳米到微米尺度上的结构多样性[38]。植物体内的二氧化硅赋予了植物刚性结构,在防止其偏倒的同时通过磨损捕食者的牙釉质起到对自身的保护作用;此外,刺莲花科植物的茎叶是由二氧化硅组成的细空心刺状毛状体,能够穿透皮肤并注射炎症物质,引发荨麻疹[39];海绵则是通过酶促聚合二氧化硅,产生大量硅质针状体,以保证其结构的稳定性,抵制捕食者的侵袭[40]

铁矿物主要存在于软体动物的牙齿、微生物和飞禽中,具有研磨或磁传感器的功能。例如结核分枝杆菌通过合成形态和尺寸可控的磁小体来利用地磁场进行游动,科学家通过仿生手段合成了这种磁小体,发现其在水溶液中具有较好的分散性,是一种理想的生物材料,目前被广泛应用于生物医学领域[41];帽贝牙齿主要由包裹在几丁质基质中的针铁矿(α-FeOOH)组成,作为有着不同取向的生物纤维纳米复合材料,具有极高的机械承载功能[42]

为了适应外界环境的变化,生物通过调控无机矿物的形成,来提高自身的生存能力和增强生物功能,例如:趋磁改造、支撑保护、磨损咀嚼等。同时也将无机物与生命体有效地结合在一起,构建出功能化的有机-无机复合材料,由此启发科学家们进行仿生材料的制备,或通过人工整合策略构建出功能化的生命体。

2 材料-生物体的整合策略

尽管生物体能够通过生物矿化发挥保护、支撑、导航等作用,许多生物体不能自发地形成矿化结构。因此,基于生物矿化的基本原理,可利用仿生矿化的策略人工诱导生物矿化,实现生物体-无机材料的结构整合。如可通过化学或化学生物学的方法对生物界面进行修饰,添加特异性矿化位点;也可在生物体内植入功能性材料来调控矿物形成,并表现出优异的特性;或通过基因工程增强生物体与矿物的亲和力来实现仿生矿化[43]

2.1 自发矿化

表面具有相对高密度的离子受体或电荷密度的生物体,可为无机材料提供成核位点。通过与带相反电荷的材料或前驱体混合,如:金属阳离子、正电性聚合物或纳米颗粒等,可以直接在生物体表面诱导矿物层的形成,即自发成矿过程。根据生物体与矿物材料间不同的相互作用,自发矿化又可分为原位矿化和矿物自组装两个方面。

2.1.1 原位矿化

表面富含负电荷的生物大分子能够通过静电作用与带正电的无机金属离子相结合,当整个体系处于过饱和状态时,矿物质会在生物体表面自发形成,其中以富含羧基、羟基和氨基的生物大分子最为显著。例如病毒表面富含带负电荷的磷酸化丝氨酸、谷氨酸或天冬氨酸端基,能够作为矿物成核位点,通过离子吸附-沉积的方式自发矿化[44, 45]。但由于生理环境中的离子浓度普遍较低,同时生物体表面富集金属离子的能力较弱,因此大多数生物体难以自发形成完整的矿化层。

在高浓度的离子环境下,生物体更易发生原位矿化。例如微碱性和富含钙离子的禽肠道环境为禽流感病毒的矿化提供了有利的环境。为了验证这一假设,研究人员将禽流感病毒与肠道模拟液混合,发现了病毒颗粒表面的原位矿化现象。如图 2(a),流感病毒颗粒表面的羧基能够富集钙离子并诱导钙矿物的沉积从而构建出矿化外壳。此外,作者还利用流感病毒矿化的现象解释了禽流感病毒从禽类传染给人类这一现象。由于人类上呼吸道细胞不含禽流感病毒的受体,在正常情况下很难被禽流感所感染,但在禽类肠道中发生自发矿化后的禽流感病毒,能够不依赖受体进入细胞,并利用溶酶体完成脱壳建立有效的感染[46]。而通过原位自发生物矿化的方法可将表面带负电荷的日本脑炎疫苗(JEV)包裹在磷酸钙矿物壳中,如图 2(b),有效避免了疫苗与水溶液接触发生氢键交换,在保证生物学特性的前提下实现疫苗的常温稳定储存[47]。如图 2(cd),对于M13噬菌体,利用噬菌体展示技术在其p8衣壳蛋白上展示谷氨酸三聚体后,PdCl(OH2)3+可以高效吸附在其表面,并进一步沿病毒外壳自发还原形成Pd多晶,利用生物还原反应而无需加热和添加还原剂[48]

图2

图2   (a) 模拟禽流感病毒矿化过程[46];(b) 矿化后JEV的TEM图像[47];(c) 以E3-M13病毒为模板形成Pd纳米线的示意图;(d)病毒表面羧基与Pd配合物通过静电作用络合,在没有任何还原剂或表面稳定剂的情况下,Pd沿着病毒外壳蛋白自发矿化[48]


2.1.2 矿物自组装

分子或纳米粒子通过非共价作用能够自组装形成连续有序结构,与原位矿化不同,自组装过程强调组分间相互作用的自发性和可逆性,是在温和条件下实现生物体修饰的重要策略。

研究表明由酸碱度诱导的肽-两亲物可用于自组装形成矿物外壳,例如将氨基末端烷基化的肽与含磷酸丝氨酸基团的亲水酯分子(PA)连接,在水中自组装形成圆柱形纤维胶束,显示出高度磷酸化的表面,为无机物的沉积提供成核位点,矿化后羟基磷灰石(HAP)的结晶c轴与纤维的长轴对齐,与骨中胶原纤维和HAP晶体之间观察到的排列极其相似,可用于类骨纳米纤维支架的制备[49]。同时亲疏水作用也可用于制造可逆交联的纳米纤维,如图 3(a),将亲水性聚乙二醇(PEG)与疏水性磷脂酰丝氨酸(PS)连接可实现胶束的自组装,再连接肿瘤靶向肽精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD),通过生物矿化的方法将耐药抑制剂VER和化疗药物MIT包裹在壳和核中,根据磷酸钙对pH的响应可实现药物缓释,用于耐药肝细胞癌的治疗[50]

图3

图3   (a) 壳-核多功能纳米粒子VM-RGD-NPs的合成路线[50];(b) TMV病毒的封装示意图[54];(c) 由海胆启发的MOF生物复合材料示意图[55]


此外,近年来金属-有机框架(MOFs)材料被广泛用于生物体的改善,与致密矿物材料相比,MOF材料一般呈多孔的高表面积网络结构,倾向于通过自组装过程与生物体相连接[51-53]。如图 3(b),简单地将烟草花叶病毒(TMV)与2-甲基咪唑混合,再加入乙酸锌溶液,由于锌离子对蛋白质的亲和力导致局部浓度过高从而促进矿化过程的发生,形成生物纳米颗粒。该自组装过程可将TMV封装在ZIF-8外壳(TMV@ZIF)内,为病毒提供抵抗外界环境变化的能力,保持长期的生物活性[54]。如图 3(c),受海胆启发使用ZIF-8封装的辣根过氧化物酶(HRP)即使放置在胰蛋白酶,甚至是沸水(100 ℃)和沸腾的DMF(153 ℃)溶液中均能保持生物活性,性能远高于其他常用的保护涂层,如CaCO3和SiO2[55]

通过离子吸附和自组装过程进行生物矿化是最简单和直接的杂交方式,可快速构建可控的新功能生命体。

2.2 界面修饰诱导矿化

由于大多数生物体表面存在的活性矿化位点较少,因此需要人为地引入矿化诱导层来加速仿生矿化过程的发生。层层自组装(layer-by-layer,LBL)技术过程是通过交替沉积带相反电荷或存在分子间相互作用的材料层进而形成具有可控厚度的化学涂层的技术。除了静电相互作用,LBL涂层还可通过非共价作用力如氢键、范德华力和亲疏水等作用与生物体连接[56, 57]

LBL技术于2008年首次被用于增强酵母细胞的矿化能力,如图 4(a),在带负电荷的细胞表层依次引入带正电荷的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)和带负电荷的聚丙烯酸钠(PAA),通过交替沉积两种电荷相反的聚电解质,在酵母细胞表面制备了一层富含羧酸根基团的矿化诱导层,为磷酸钙矿化提供了成核位点,从而在高钙环境中形成磷酸钙外壳,提高酵母细胞的储存时间,同时实现酵母细胞的保护和输送[28, 58]。此外,也可借助纳米涂层的堆积实现纤维的矿化,在骨修复和再生方面有巨大潜力,如图 4(b),电纺纤维经聚多巴胺修饰后,依次吸附阳离子І型胶原蛋白和阴离子硫酸软骨素,可构建仿生界面诱导HAP的沉积,具有促进骨-植入物的粘合和骨诱导的作用[59]

图4

图4   (a) 在酵母细胞上构建人工CaP矿物壳[58];(b) 通过LBL过程制造具有生物功能的骨支架的示意图[59];(c) 单个蓝藻的二氧化硅封装过程[61]


生物硅化也是另一重要的矿化过程,但由于细胞表面缺乏硅化相关的蛋白,如硅蛋白等。天然蓝藻很难实现自发硅化,故光合作用的效率常受到环境的胁迫影响,如高光照、紫外线辐射和高温,限制了它们在工业上的应用[60]。如图 4(c),通过引入带负电的聚苯乙烯磺酸盐(PSS)来促进带正电季胺基团的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)的沉积,可在室温下快速诱导原位硅化,减弱强光对其的抑制作用,使得蓝藻在强光下的光合作用更加高效[61]。或在单细胞蓝藻表面引入Au@L-半胱氨酸构成的纳米生物界面和介孔二氧化硅层,稳定的双层外壳不仅能有效保护细胞免受酸碱度变化以及强紫外线辐射的影响,还能保证活细胞与外界环境之间的阳光运输和质量交换,从而创建出一种可重复使用、高活性的“光合生物反应器”[62]

通过添加聚电解质可以为不能自发成矿的生物体提供足够的成核位点,为构建新功能生命体提供强有力的支持,但还需注意成壳稳定性和生物毒性的问题,以预防其脱落并保证生物体的活性。

2.3 胞内矿化

在通过与材料的整合来改造生物体的方法中,除了在生物体表面引入矿化外壳外,还可以在生物体内部进行仿生矿化,构建一种特殊的“人工细胞器”或细胞内支架,有助于调节细胞离子稳态和发挥传递信号的作用,帮助生物体及时对外界刺激做出反应,赋予生物体新的功能[63, 64]

利用细胞的内源性环境可以诱导细胞内产生矿化位点。例如有研究在酿酒酵母细胞内原位合成了具有生物活性的CaCO3纳米颗粒,使酵母细胞成为一种新型纳米材料的反应器。如图 5(a),以Ca(OH)2饱和溶液作为钙源,在活酵母细胞内与呼吸作用产生的CO32−反应,能够成功在酵母细胞内制备出CaCO3纳米颗粒。其与生物大分子(如蛋白质、多糖)相互作用被固定于细胞内部,可用作抗癌药物载体[65]。除了CaCO3,HAP也可通过内源性矿化作用在酵母细胞内生成,作为细胞内的纳米矿物支架[66]

图5

图5   (a) CaCO3纳米颗粒的内源性生成[65];(b) 限制纳米团簇生长的病毒衣壳(左)及其截面图(右) [67]


尽管生物体内构建的功能材料展现出灵活、优异的性能,但同时也存在着一定的空间约束。如图 5(b),研究通过改变溶液的pH和金属离子浓度来控制病毒衣壳上离子通道的打开和关闭,并使用NaBH4还原[PtCl4]生成纯Pt NPs或加入额外金属离子(Co或Fe)后可合成Co-Pt、Fe-Pt合金纳米团簇,与传统方法相比,有效限制了纳米粒子的聚集,也控制了合金的尺寸[67]

与形成矿化外壳的方法相比,生物体内的改性对生物体的影响更大,效果更明显,但也面临着生存期短、合成路线复杂、具有潜在毒性等挑战,需要科学家们进一步的研究和改进。

2.4 基因工程修饰诱导矿化

自然界中生物体的自发矿化能力受到生物矿化相关蛋白质的调控[68]因此,对于缺乏矿化蛋白的生物体来说,可以通过基因工程技术引入编码生物矿化相关蛋白的基因,使生物体获得具有遗传效应的矿化能力,能够自发利用该蛋白与材料相互作用。

将诱导矿化的肽段整合在表面能够实现生物体的界面矿化。例如研究人员在人类肠道病毒71型(EV71)颗粒表面的合适位点插入成矿肽磷酸盐螯合剂(N6p)或钙螯合剂(NWp和W6p),如图 6(ab),从而使疫苗能够通过自主地将磷酸钙引入表面来获得矿化外壳,提高疫苗的热稳定性,并保证疫苗免疫原性[69]。外壳蛋白氨基端被插入半胱氨酸的基因工程化烟草花叶病毒(TMV),可促进各种金属簇在其表面的沉积[70]。除了病毒,基因工程技术也被广泛用于细菌[71]、酵母细胞[72]、硅藻[73]等其他多种生物。如图 6(c),将衍生自DMP-1的两个β结构形成肽和HAP成核肽分别编码到M13噬菌体的表面,通过相邻噬菌体β结构的驱动自组装成束,再从HAP过饱和溶液中精确成核到工程化的噬菌体束内,形成的HAP晶体具有c轴优先取向,可实现类骨生物材料复合体的合成[74]

图6

图6   (a) EV71基因组及VP1的β-(BC)环插入位点;(b) 携带成核肽的工程化EV71矿化示意图[69];(c) 工程化M13噬菌体构建生物纳米纤维的过程[74]


细胞内的生物矿化也可以通过基因工程的方法实现。例如在低铁条件下,铁响应转录激活因子Aft1会转移到细胞核中调节铁的摄取。因此细胞内引入Aft1上调的铁蛋白(Ft)突变体,可实现细胞内铁矿物的有效生成,构建出磁传感器,用于多尺度细胞成像[75]。受驱磁细菌的启发,有研究开发了一种结合铁氧化和铁螯合功能的新型基因构建体,通过在细菌内构建结合深红红螺菌十聚铁氧化酶与铁结合肽M6A的融合蛋白,使细菌能够在“超顺磁性”大分子复合物中积累铁,在磁场中被捕获,用于体外和体内的磁共振成像(MRI)成像[76]

目前,多数生物体的蛋白序列和三维结构已被解析,因此基因工程策略可以被广泛且有效地应用于生物体的改造,是一种新颖、目的性强的策略,但也同时面临着操作复杂、可能引起基因突变等问题,有待人们进一步探索。

总的来说,借助仿生矿化来构建新功能生命体是一种行之有效且意义重大的策略,可根据不同的需求从形式多样的构筑方法中选取合适的途径来实现储存、保护和支撑等作用,对于生物体功能的改进具有极大的推进作用,值得人们继续深入研究和扩展其应用。

3 构筑新功能生命体

研究者们通过模仿生物体实现仿生矿化的策略,在细胞表面或内部引入材料以构筑新功能生命体,在保证生物体自身正常生命活动的同时赋予其特殊的性质,被应用于环境控制、能源生产、生物催化、医学治疗等多个领域,具有非常广阔的前景。

3.1 细胞壳化

3.1.1 刚性外壳

细胞表面壳工程化的策略是一种可控、简单且快捷的细胞修饰方法,常被用作保护生物体免受外界环境的伤害。由于功能外壳对生物体的内环境和新陈代谢过程影响较小,是目前细胞工程领域中应用最为广泛的材料-生物体整合方法。金属配合物、无机矿物材料和高分子聚合物常被用于制造生物体的刚性外壳,如MOF、CaP、SiO2以及天然或人工合成的聚合物等,具有御防外界的胁迫、疾病治疗、环境保护、生物催化和导电传感[77]等作用。

通过仿生矿化能在细胞外部引入“铠甲”用于细胞的保护。酵母细胞壁主要由带负电的多糖组成,难以引起二氧化硅的自发矿化和沉积,通过LBL技术用带正电的PDADMAC和具有良好生物相容性的带负电荷聚苯乙烯磺酸盐(PSS)包被酵母细胞,在近生理条件下,通过静电相互作用吸附溶液中带负电荷的二氧化硅纳米粒子,可形成连续的均匀二氧化硅层,赋予细胞高温防御能力,同时也不会损害细胞活力[78]。此外,依赖于二氧化硅良好的水合作用能力,能为病毒提供一个封闭的无水纳米环境,有效避免化学反应的发生,如图 7(a),研究在EV71病毒表面引入二氧化硅层,可显著改善疫苗的热稳定性,室温下储存35天后仍可保持90%的效果[79]。近来也有研究通过液-液相分离从带相反电荷的聚电解质混合物中构筑凝聚层微滴外壳用于保护酵母免受氧化损伤[80]

图7

图7   (a) 热稳定病毒的仿生方法[79];(b) 鼻腔疫苗设计原理[85];(c) 由生物矿化诱导的可光合产氢绿藻聚集体;(d) 聚集的小球藻的空间功能分化[87]


矿化外壳还可用于新型生物催化剂的开发。生物催化剂如酶、微生物细胞等具有高催化效率和反应速度,被广泛应用于精细化学品、药物和燃料的制备和加工等领域[81],但其容易受到高温、有机溶剂和环境pH变化的影响而失活。因此将粪产碱菌与多孔磷酸钙(CaP)矿物壳和Fe3O4 纳米粒子结合,CaP外壳可保护生物催化免受有机溶剂胁迫,Fe3O4纳米颗粒提供磁分离和回收的功能,矿化的细菌则作为循环的皮克林(Pickering)界面生物催化剂。无机-细菌复合结构显著提高了生物催化剂的催化效率和重复使用性[82]。近年来纳米酶也因其高催化效率、强稳定性和易于制备等优点引起了人们的兴趣[83],其中具有多种酶活性的二氧化锰(MnO2)纳米酶包裹的酵母细胞能够用于增强细胞对环境(包括脱水、裂解酶、紫外辐射等)的耐受性,保证细胞在储存两周后仍保持其高活性。并在去除外壳后,迅速恢复正常的生长和功能,体现了生物体-材料复合体的多酶活性[84]

矿化外壳在医学领域也有着广泛的应用,如黏膜免疫、抗体的有效释放等。基于磷酸钙材料在细胞和组织上的强大粘附能力,如图 7(b),用CaP纳米壳包裹病毒,可增强与鼻粘膜组织的粘附作用,有利于不依赖受体的摄取和鼻腔内局部IgA反应的升高,从而引发增强性的全身抗体反应[85]。单克隆抗体(mAb)只能识别和中和细胞外蛋白而无法进入细胞,通过将抗体原位CaP矿化,经过胞吞作用可以有效地输送到受感染的细胞中释放抗体,抑制病毒复制[86]

此外,材料外壳的构建也常被用于解决能源与环境问题。绿藻体内的氢酶会在缺氧环境下被激活进行光合作用产生氢气,如图 7(cd),使用二氧化硅去包裹绿藻,多个绿藻会逐渐粘合形成绿藻复合体,外层的绿藻进行正常的光合作用产生氧气的同时,隔绝内部绿藻和外界的接触,内部的绿藻通过光合产氧和呼吸作用的耗氧平衡,制造出一个既能维持绿藻细胞光合活性又能够激活氢酶的无氧条件,从而实现光合产氢,效率等同于正常的光合作用,可在没有破坏绿藻正常生命过程的前提下实现持续产氢,工艺上更具操作性与便捷性,为化学手段改造光合生物提出了全新的思路[87]

环境中大量繁殖的蓝藻会消耗水中氧气并释放蓝藻毒素,导致水生生物的大量死亡,对水资源和生态系统构成重大威胁,研究发现二氧化硅纳米粒子可以在PDADMAC聚合物的存在下自发地结合到蓝藻上,得到的蓝藻-SiO2复合物可以在水中保持沉积状态,显著抑制蓝藻的光合生长,减少水华事件的发生,是一种有效的环境控制策略[88]

3.1.2 柔性外壳

与“硬”保护不同,细胞外“软”保护主要采用柔韧的高分子材料和生物大分子,具有一定的流动性,可以更好地保证生命体的基本功能和生物活性,最大限度地减少构建新功能生命体过程中对生物体的损害。

利用仿生手段可在红细胞表面构建柔性外壳。俗称“熊猫血”的Rh阴性血是稀有血型,因此将RhD阳性血液转化为RhD阴性血液具有极大的临床应用价值。有研究表明通过酶去除红细胞(RBC)抗原可成功地将A型或B型红细胞转化为O型红细胞[89],但这一过程与Rh抗原的免疫原表位无关,且Rh相关多肽的缺失会导致整个红细胞膜的裂解,对核酸酶血型的决定基因进行编辑也有可能会引起突变,引发未知的风险[90]。为解决该问题,如图 8(a),研究构建了一种唾液酸与盐酸酪胺交联的柔软凝胶网络结构,能保证红细胞良好的变形性,使其能在动物体内各个部位进行气体及能量运输,并基于其优越的生物亲和性和对细胞膜表面抗原的掩蔽作用,实现了“通用熊猫血”的人工构建和安全输血,展示了良好的临床转化前景[91]

图8

图8   (a) “通用熊猫血”的人工构建[91];(b) 可用于细胞打印的水凝胶设计[92]


同时,可塑的生物活性水凝胶作为柔性外壳在组织工程领域也有广泛研究,例如3D细胞培养和组织再生的平台。如图 8(b),一种交联的、可生物降解的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEG-PCL)三嵌段聚合物水凝胶,兼具高弹性和高韧性,可以自由进行拉伸、压缩和扭曲过程而不会出现明显的断裂,用于细胞打印可实现细胞在材料中至少7天的培养[92]。而用含有Arg-Gly-Asp序列的细胞粘附肽修饰的微尺度海藻酸盐凝胶和未经修饰的凝胶组成双峰水凝胶,经单轴冷冻干燥引入各向异性排列的微通道,可以驱动骨髓基质细胞在经过修饰的凝胶微通道中粘附,并分化成神经元和神经胶质细胞,实现对细胞粘附空间位置上的可控性[93]

3.1.3 病理性外壳

除了生物体内正常形成骨骼、牙齿等硬组织的矿化过程,也同时存在着异常的矿化现象,会形成如同结石、龋齿等对生物体有危害的物质。通过对异常生物矿物的特征和形成机理的深入研究,并借鉴新功能生命体的构建方法,可将其转化为对人类有益的方式,达到预防和治疗疾病的效果。

通过诱导病理钙化可实现肿瘤治疗。基于癌细胞中的叶酸受体(FR)上调的现象,研究提出了一种癌细胞靶向钙化(Cancer-Cell-Targeting Calcification, CCTC)的无药物癌症治疗方法,如图 9(a),由于叶酸(FA)的羧酸基团可以与生物液中的Ca2+特异性结合,从而促进钙矿物质的成核,诱导选择性吸附FA分子的癌细胞钙化死亡,与传统的化学疗法相比,CCTC治疗可以有效抑制肿瘤的生长并限制其转移,而不会损害正常细胞,从而大幅度地提高治疗的存活率[94]。除了对生物体进行界面修饰,还可增强磷酸钙粒子与癌细胞的粘附程度。通过向磷酸钙添加阴离子羧甲基纤维素(CMC)聚合物和光敏卟啉染料,再附着一层阳离子聚乙烯亚胺(PEI)来反转这些颗粒的电性,可大大增强癌细胞对磷酸钙的吸收率,具有很好的治疗效果[95]

图9

图9   (a)癌细胞靶向钙化的无药物治疗原理[95];(b) pH响应性过氧化钙纳米粒子的设计[96]


病理性钙化还可用于肿瘤诊疗一体化。例如基于Ca2+独特的细胞毒性机制,如图 9(b),由pH敏感的透明质酸钠修饰的过氧化钙纳米颗粒,在酸性肿瘤微环境中可缓慢分解为游离的Ca2+和H2O2,从而改变钙离子通道,阻碍钙离子信号的准确传递,导致癌细胞死亡,同时在Ca2+富集的过程中,有利于产生肿瘤钙化的倾向,抑制肿瘤在体内的生长,也可以通过CT成像应用于治疗效果的监测;相反,由于正常细胞有足够的过氧化氢酶使外源性Ca2+可通过钙通道泵出或储存,具有一定的耐受性,因而该项研究在临床癌症治疗中显示出巨大的潜力[96]

3.2 胞内仿生细胞器

仿生细胞器常被用于生物医学领域。例如在癌症治疗手段中,化疗药物并不能区分健康和病变细胞,因此研究构建了一种用以捕获和释放化疗药物的仿生细胞器,如图 10(a),通过巯基修饰将富含GC碱基双链寡聚核苷酸(ODN)组装到金纳米笼中,由于化疗药物如阿霉素(DOX)进入细胞核会优先插入富含GC碱基的核酸序列,因此材料具有良好的药物捕获性,当细胞内Au-ODN浓度高于临界保护浓度时,能有效捕获进入肝细胞内的DOX,保护肝脏免受损伤;当肿瘤组织细胞内的Au-ODN低于临界保护浓度时,该材料对进入肿瘤内的DOX捕获作用微弱,对药物的抗肿瘤作用基本没有影响。此外,金纳米笼材料具有良好的近红外光(NIR)热效应,对肿瘤进行近红外照射时,可使肿瘤细胞内被Au-ODN捕获的DOX再次释放,继续发挥抗癌作用,进一步消除瘤内Au-ODN对DOX的抗肿瘤作用的潜在影响,实现了在癌症化疗中既保证药物抗癌效果又保护肝脏免受药物损伤[97]。同时,还可利用胞内仿生细胞器来靶向递送药物。如图 10(b),表面叶酸(FA)功能化的胞内矿化酵母细胞nHAP@yeasts-FA不仅保留了细胞原有的性质和功能,还有极大的药物负载能力,可以作为载体靶向肿瘤,进行药物的有效递送和释放,基于肿瘤的FA依赖性和羟基磷灰石(HAP)纳米粒子的pH敏感性来实现双重响应释放的效果,能显著抑制肿瘤生长,同时显示出低毒性,为纳米矿物质提供了一种生物友好的胞内合成和应用策略[66]。如图 10(c),胰岛素在矿化CaP相内浓缩和复合产生CaP-胰岛素纳米颗粒(BINP),可促进胰岛素的大规模细胞摄取,经过溶酶体逃逸机制到细胞质中有效释放,模拟了细胞内改善糖代谢的机制,保护胰岛素免受生物降解,对胰岛素抵抗可产生长期的治疗作用[98]。或将Fe0纳米颗粒锚定在肿瘤靶向红细胞膜包覆的葡萄糖氧化酶内腔中,形成铁矿化葡萄糖氧化酶(GOx-Fe0@EM-A),在肿瘤部位进行近红外光照射后,红细胞膜破裂,通过光热效应实现超小纳米GOx-Fe0的光驱动释放和肿瘤深度渗透,实现肿瘤的有效根除[99]

图10

图10   (a) 可灵活捕获和释放抗癌药物的Au-ODN的构建[97];(b) 用于药物靶向递送的矿化酵母细胞nHAP@yeasts-FA的设计[66];(c) 可有效改善糖代谢的矿化胰岛素工作原理[98]


此外,植入性生物燃料电池也引起了研究者的关注。以红细胞为原料,通过嵌入超小羟基磷灰石(HAP、Ca10(PO4)6(OH)2)来制备生物燃料电池的正极材料,具有高电催化活性、稳定性和选择性,并在保持细胞的原始生物学特性的同时,通过HAP的-OH基团与血红蛋白的相互作用增强了催化氧还原反应,实现了电子的直接传输,而无需转移介质[100],展现了纳米材料可以作为人工细胞器实现超级细胞的构建,为材料和生物的功能化装配提供了新概念和新思路。

胞内细胞器还可用来开发能源生产。例如研究以金纳米团簇(AuNCs)的形式引入了一种细胞内的、生物相容性好的光吸收剂,以规避现有光合生物混合系统电子转移缓慢的动力学问题,将AuNCs转移到非光合细菌中,使得CO2光合作用产生乙酸成为可能,同时AuNCs还可以作为活性氧(ROS)的抑制剂来维持细菌的活力,有效地收集阳光并将光生电子转移到细胞代谢中,实现CO2的持续固定[101]

3.3 其他特殊作用的仿生矿化策略

除了材料与生物体结合构建仿生外壳或人工细胞器以外,还可设计出具有特殊作用的无机-生物复合材料,应用于工业生产和环境保护等领域。

海洋环境中金属材料的变质和腐蚀往往会造成不可估量的经济损失和重大的安全隐患。传统的缓解手段如涂层和腐蚀抑制剂通常含有重金属、铬酸盐和挥发性的有机化合物,对环境不友好且难以维护,因此需要开发一种环保的方法用于钢材的保护。如图 11(a),基于生物诱导矿化过程的启发,选取海洋细菌枯草芽孢杆菌(B. subtilis)作为研究对象,其具有将各种有机物分解为NH4+和HCO3的能力,从而引起环境pH的升高,并可分泌能催化CO2水化生成HCO3的碳酸酐酶,从而当环境中阳离子达到一定浓度时,表面丰富的氨基酸可作为成核位点诱导矿物的生成,制备出一种致密的有机-无机混合薄膜,用于保护钢铁免受环境的腐蚀[102]

图11

图11   (a) 海洋细菌通过协同生物矿化抑制钢铁腐蚀[102];(b) 矿化固废煤矸石作为环保地下充填材料[103]


固废煤矸石(CG)常与水泥混合作为地下回填材料,在中国各地的煤矿中得到广泛应用。但由于水泥的存在,这种材料在其生产、制备和运输过程中往往对环境会造成严重污染。而微生物诱导碳酸盐沉淀技术作为一种无水泥环保技术,常被用于生产生物矿化材料,固结松散颗粒,同时微生物生长环境也与地下温度相适应。因此如图 11(b),研究模拟自然矿化作用,利用巴斯德氏芽胞杆菌来产生具有一定晶型和结合作用的碳酸钙(CaCO3)晶体沉淀来以填充孔隙,将固体废弃物煤矸石颗粒结合成一个具有高生物矿物质含量的整体,达到很好固化废料颗粒的目的,与水泥混合地下回填材料相比,对环境更加友好[103]

4 结语

通过师法自然,仿生矿化研究领域实现了从生物体系对材料结晶的调控到利用材料改进生物体性能的扩展,并已经取得了快速的进展,为生物和材料的可持续发展提供了新的方向,但是该领域仍然存在一些改进空间和挑战。

首先,目前利用材料改性的生命体大多是病毒,酵母细胞和动物细胞,还有很大部分微生物和植物尚未被挖掘利用[104],由于生物体具有选择与特定材料结合的能力,表现出感知并适应外界环境的能力,因此,研究者可以从目的出发,快速找到适合生物体的材料,从而构建出更加智能的新功能生命体。

其次,生物体内的材料通常是在温和的条件下合成的,能耗相对较低,因此利用生物自身的生理环境进行材料的合成和整合也是未来的研究趋势之一[105],而在人工构筑新功能生命体的过程中,为减少对生物体损害,保证生物活性,整合条件包括温度、压力、离子浓度、pH、毒性、反应时间、生物降解性、协调性等都应被纳入考虑范围之内[29],避免高温高压等合成条件。

此外,为了更好地控制矿物生成的成核、生长、相变和粒子组装过程,还可在矿化过程中引入一些分子添加剂或稳定剂[106]。例如,用小分子三乙胺(TEA)稳定磷酸钙离子团簇,将其挥发可诱导离子团簇聚集融合成一个结构连续的整体,在牙釉质表面构建一个由结晶体到无定型前驱体的连续界面,随后通过氟离子的诱导实现晶体的外延生长[107];添加富含羧酸的聚丙烯酸(PAA)作为一种很好的调节剂来稳定磷酸钙液体前驱体(PILP),其良好的骨诱导性允许渗透入胶原纤维中进行纤维内矿化[108],或用于合成尺寸分布均匀的纳米磷酸钙[109]

总而言之,通过材料改性生物在细胞保护、疫苗储存、信号屏蔽、活性增强等领域均取得了较为重大的成果,证明了仿生矿化策略的可行性和有效性,也进一步模糊了生物和非生物的界限,相信随着未来生物学和材料学的发展,新功能生命体的应用将越来越广泛。

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