泛素(ubiquitin，Ub)是一类分子量约为8500且高度保守的小分子量蛋白质。它由76个氨基酸组成，并广泛存在于真核生物细胞中。泛素的主要功能是参与真核细胞中大部分蛋白质的降解，而蛋白酶体就是泛素介导蛋白质降解的场所。在这里，被“打上”泛素标签的蛋白质会被降解成多肽片段，以供细胞重复使用。此外，泛素的功能还体现在多种细胞活动如DNA修复、信号传导、转录翻译、免疫应答等^[1]。2004年的诺贝尔化学奖授予了Aaron Ciechanover、Avram Hershko和Irwin Rose三位发现泛素介导蛋白质降解的科学家(图1)。

近年来，人们逐渐认识到泛素-蛋白酶体系统的异常与多种不同疾病的发生密切相关，包括神经退行性疾病如阿尔兹海默症、亨廷顿病、癌症、心血管和呼吸系统疾病等^[2]。以神经退行性疾病为例，外源或者内源因素可以引发神经细胞内外蛋白质的错误折叠，从而影响泛素-蛋白酶体的降解功能而导致大量蛋白的异常堆积，甚至细胞死亡。而肿瘤的发生则与细胞过度增殖以及抗凋亡能力增强有关。泛素-蛋白酶体通过促进抑癌蛋白如P53的降解或者阻滞致癌蛋白降解而影响肿瘤细胞的存活。在过去几十年的研究中，泛素-蛋白酶体(ubiquitin-proteasome system，UPS)作为一个庞大的蛋白质机器，是科学家们研发疾病潜在有效药物的重要靶点^[3]。而经过改进后的一些有效的研究方法也已开发并用于实验教学^{[4, 5]}。2003年，调控蛋白酶体机器的活性小分子硼替佐米(Bortezomib)被美国FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤。后续十几年，又有全新的泛素-蛋白酶体抑制剂或者现有活性药物的组合疗法应用于治疗癌症，卡菲佐米(Carfilzomib)及碘沙唑米(Ixazomib)等也已获得临床批准。本文将主要介绍参与泛素-蛋白酶体通路的酶以及相关的活性药物。

人泛素蛋白的三维结构如图2a所示。泛素在细胞内的存在方式主要有游离或以同底物蛋白质共价结合的形式。泛素与目标蛋白质(substrate)结合的位点、长度以及拓扑结构虽都不尽相同(图2b)，但其调节蛋白质的降解过程却是通过三步级联反应完成，需要泛素活化酶E1 (ubiquitin-activating enzyme)、泛素结合酶E2 (ubquitin-conjugation enzyme)以及泛素连接酶E3 (ubiquitin-protein ligase)的共同参与，催化泛素结合至目标蛋白。被泛素标记的蛋白质或被蛋白酶体水解，或被细胞内吞，又或被去泛素化酶(deubiquitinase，dub)移除泛素标签，从而逃脱被降解的命运(图3)。

在哺乳动物细胞中，目前已发现2个泛素活化酶E1、40多个结合酶E2以及约700多个连接酶E3。这些酶在泛素化过程中起到不同的作用。Uba1和Uba6是哺乳动物细胞的2个E1。作为一类ATP依赖的酶，E1通过与泛素的C端氨基酸形成硫酯键从而激活泛素。活化的泛素可与泛素结合酶E2结合，形成的E2-Ub复合物协同特异性的E3将活化的泛素转移至蛋白质底物完成泛素化过程。泛素连接酶E3的调控机制最为复杂，它可直接决定泛素介导底物的降解途径。目前，已发现的E3约有700个。按照结构的不同，E3主要包括含有环指结构RING (really interesting new gene)、含有HECT (homologous to E6AP C‑terminus)结构以及含有U-box的三类E3s。

去泛素化的过程主要由去泛素化酶DUBs来完成。DUBs是一类数量很大的蛋白酶类家族，它主要通过水解泛素羧基末端的肽键或异肽键，将泛素分子特异性地从泛素化蛋白质底物中水解下来，以保持细胞中游离泛素的水平。去泛素化酶的功能还包括调节修饰组蛋白、p53信号传导及应答DNA损伤的功能等。根据DUBs催化活性区域的序列同源性，人去泛素化酶可分为两大类：半胱氨酸蛋白酶家族和金属蛋白酶家族。半胱氨酸蛋白酶家族包括泛素特异型蛋白酶(ubiquitin specific proteases，USPs)，泛素羧基末端水解酶(ubiquitin carboxy-terminal hydrolases，UCHs)，Machado-Josephin结构域蛋白酶(Machado-Joseph disease protein domain proteases，MJDs)和卵巢肿瘤相关蛋白酶(ovarian-tumor proteases，OUTs)。金属蛋白酶家族则包含MPN(+)/JAMM蛋白酶家族。

作为细胞中重要的且复杂的大型全酶蛋白质机器之一，人源蛋白酶体全酶包含至少33种不同的亚基，总原子质量约为2.5 MDa。在结构上，26S (subunits)蛋白酶体是由20S核心颗粒和两个19S调节颗粒的亚复合物构成。19S调节颗粒的主要功能是识别并去折叠带有泛素标记的蛋白质底物，并将去折叠后的蛋白质底物转运至20S核心颗粒中进行降解。20S核心颗粒分别由α外环和β内环构成。β内环是执行蛋白质降解的场所(图4)，其中β1、β2和β5亚基因分别具有半胱天冬酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性位点，执行降解活性。随着冷冻电镜技术的发展和应用，人们对蛋白酶体这一大分子机器的结构和功能研究得以不断深入，并逐步呈现了原子水平的蛋白酶体和底物相互作用的动态过程，从而有助于开发活性化合物用于调控蛋白酶体复杂多样的功能。

针对泛素-蛋白酶体通路设计的选择性抑制剂药物涉及参与泛素化过程、去泛素化过程的酶以及接头蛋白等^[6]。由于通路各组分的基因多态性，获取特异性的抑制剂是判断药物是否有效的重要因素之一。

目前已报道的有较好抗肿瘤效果的药物有10余种，且用于临床治疗的药物以蛋白酶体抑制剂居多^[7]。部分蛋白酶体抑制剂如表1所示。

Bortezomib (PS-341)是首个被FDA批准的以泛素-蛋白酶体通路为靶点的蛋白酶体抑制剂类药物。Bortezomib是一种硼酸二肽，它可以特异性地与20S蛋白酶体的β5亚基的苏氨酸的活性部位结合，有效抑制胰凝乳蛋白酶活性。同时，它也可以与β1亚基的苏氨酸的活性部位结合，抑制半胱天冬蛋白酶活性。Bortezomib是一类高选择性的可逆抑制剂，也是一种被批准用于治疗多发性骨髓瘤的药物。暴露于Bortezomib可以稳定p21，p27，p53蛋白以及促凋亡Bid和Bax蛋白，阻断细胞内NF-κB通路的激活，导致肿瘤细胞死亡。

Bortezomib在治疗癌症的过程中，暴露出的常见问题包括药物脱靶、与蛋白酶体抑制相关联的细胞毒性，以及机体由此可能激活其他的降解蛋白质途径，从而产生耐药性等。对于一些多发性骨髓瘤患者来说，单一Bortezomib疗法的治疗效果并不十分理想。为突破使用单一药物的局限性，研发的第二代蛋白酶体抑制剂如卡菲佐米(Carfizomib)和碘沙唑米(Ixazomib)等也已被FDA批准上市(表1)。

作为第二代蛋白酶体抑制剂类药物，Carfizomib于2012年被FDA批准用于治疗已经使用过Bortezomib治疗的多发性骨髓瘤患者。与Bortezomib不同，Carfizomib属于环氧酮类化合物，具有独特的化学结构和选择性，它的环氧酮部分与苏氨酸的羟基和游离α-氨基相互作用，以不可逆的方式形成吗啉加合物。Carfizomib与蛋白酶体其他β亚基如β1、β2的结合能力要弱于Bortezomib，从而降低了对胰蛋白酶、半胱天冬酶的活性抑制^[6]。Ixazomib是首个被批准的口服硼酸酯类蛋白酶体抑制剂。数据显示，Ixazomib可以以“孤儿药”或者联合其他蛋白酶体抑制剂给药的方式，用于治疗多发性骨髓瘤、全身性轻链淀粉样变等其他恶性肿瘤。此外，蛋白酶体的特殊亚基类抑制剂(β1i、β2i、β5i)，也可通过与亚基的结合，以可逆或者不可逆的方式占据蛋白质降解的结合位点，抑制降解、阻滞细胞周期，从而有效抑制肿瘤的复发。

去泛素化酶抑制剂作用于半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶^[8]。现已开发的与19S蛋白酶体相关的去泛素化酶主要有UCHL5 (or UCH37)、USP14、USP7和PSMD14 (POH1)等(表2)。P5091属于噻吩类小分子抑制剂，它与P22077主要作用于USP7。研究发现，对Bortezomib治疗产生耐药性的多发性骨髓瘤患者中使用P5091，可诱导肿瘤细胞的死亡^[9]。WP-1130、b-AP15均可作用于多个去泛素化酶。多泛素化修饰蛋白的累积阻滞细胞周期，从而有效抑制结肠癌等肿瘤的发展。WP-1130与Bortezomib有协同的肿瘤治疗作用，而b-AP15更多用于治疗耐Bortezomib药性的肿瘤^{[10, 11]}。作为金属蛋白酶家族成员之一的去泛素化酶PSMD14，其在细胞内水平负调控多发骨髓瘤细胞的增殖以及患者的生存率^[8]，由此，Cleave Biosciences公司设计合成了针对PSMD14的特异性抑制剂并已进入临床试验前期。

E1是泛素化体系中的第一个酶。两种E1 (Uba1和Uba6)调节了下游泛素化反应。因此，调控E1活性可调节下游某些与肿瘤相关蛋白的泛素化。目前，已有多种E1抑制剂被报道^[12]。例如，Uba1的抑制剂PYR-41和PYZD-4409。但已进入临床试验的只有类泛素分子NEDD8的E1活化酶抑制剂MLN4924 ^[7]。抑制E1会导致泛素化底物的累积，而E1较差的特异性和成药性都成为发展E1抑制剂的绊脚石。

相比屈指可数的E1，目前已报道的E2有40余个。因此，E2抑制剂具有较强的选择性，提供了在肿瘤治疗方面更大的空间。如抑制剂CC0651通过与CDC34的结合而发生的构象改变阻滞了Ub的级联反应。

E3的数量约有近700个，它能够特异性识别蛋白质底物，从而使得它成为多种相关疾病的治疗靶点。人们可以通过调控底物蛋白质的E3来调节目的蛋白，从而有针对性地提高疗效(表3)。以MDM2为例。MDM2是肿瘤抑癌基因p53的E3。阻断MDM2和p53的相互作用，可以稳定p53，从而阻滞肿瘤细胞周期，促进凋亡。Nutlin-3是第一个以MDM2为靶点的E3抑制剂^[13]。Nutlin-3模拟并占据p53与MDM2的结合位点，从而避免p53被泛素标记而降解。作为另一种稳定p53的小分子药物，RITA通过与p53的N端结合从而抑制p53与MDM2之间的相互作用。被批准用于治疗多发性骨髓瘤(MM)、套细胞淋巴瘤(MCL)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes)的药物^[16]以及部分代表性临床试验药物如表3所示。

以泛素-蛋白酶体为靶点的药物，如去泛素化酶抑制剂，蛋白酶体抑制剂等，已经在神经退行性疾病以及癌症等疾病的治疗中产生了积极的效果。但现阶段药物的特异性、耐药性以及治疗过程中的脱靶效应所引发的副作用等，都限制了其在临床治疗过程中的应用。因此，通过不同药物的联用治疗以及更加合理的药物设计策略是解决上述问题的抓手。我们相信，随着近期对蛋白酶体结构的最新阐述^{[14, 15]}，人们对泛素介导的蛋白质降解调控机制以及蛋白质间相互作用的信息网络会有更加深刻的认识，从而能够更加精准地针对某一特定的生理过程设计特异的药物。