药物的虚拟筛选技术是大学生物和化学信息学教学中的一个重要组成部分，它不仅仅涉及到小分子与受体的相互作用，而且需要考虑药物分子的很多属性，如类药性五原则(Lipinski’s rule of five)、泛筛选干扰化合物(PAINS)和毒药物动力学(ADME)：吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)等。分子对接技术是药物虚拟筛选的一个研究分支，它能够预测小分子与受体的结合能力，通过分子对接技术把药物数据库中的小分子逐个对接到受体的活性位点，再根据打分函数对结果进行排序，这样就能完成药物的虚拟筛选流程。目前，已经有很多文献报道通过Autodock Vina实现靶向受体活性位点的药物虚拟筛选^[1]。Schrödinger模块中Glide软件也可以用于药物的虚拟筛选，根据测试报道，Glide在获得药物分子最佳pose和最佳打分pose的成功率上要比Autodock Vina更有优势^[2]。不仅如此，在药物分子的预测和发现过程中，越来越强调系统的药物设计，也就是需要考虑药物的ADME和PAINS等整体属性；在药物虚拟筛选的过程中能够系统考虑药物分子的各种属性，筛选出来的结果就能避免在假阳性化合物上浪费大量的时间，大大提高药物发现的效率。在大学生物和化学信息学的课堂里系统讲述药物虚拟筛选的流程，比单独讲述分子对接技术更系统科学，能够大大提升学生对药物设计的认识水平。

Schrödinger是一款综合的药物设计软件，它包含了大多数流行的药物设计模块，可以实现很多功能，如同源建模、分子对接、蛋白-蛋白对接、QSAR和药物虚拟筛选等。同时，Schrödinger还有很友好的图形界面和虚拟筛选流程模块，可以简单快速地实现药物虚拟筛选，特别适合在课堂上进行演示。本文结合药物虚拟筛选理论在大学生物和化学信息学中的教学应用，重点介绍了Schrödinger (version 2017)药物虚拟筛选模块的基本功能和应用。

Schrödinger是一款用于分子建模、药物设计和材料科学的综合应用软件，尤其是在药物发现领域，它有着很好的应用市场和前景，它可以实现基于受体结构-配体极性、受体-配体诱导契合、刚性、柔性的分子对接等，它的官方网址是：www.schrodinger.com。其中Maestro是Schrödinger用于药物设计模块的可视化图形界面(如图1所示)，通过点击按钮就可以快速实现对应的功能，如点击Import Structures (快捷键为Ctrl+I)按钮就能导入受体和配体的卡通结构图(图1)。其中Glide ^{[3, 4]}是Schrödinger虚拟筛选模块中的重要组成部分，通过Google学术的检索功能可以发现已经有> 5000次的学术论文引用了该软件。Glide可以实现药物分子的高通量虚拟筛选(HTVS)、标准精度筛选(SP)、高精度筛选(XP)和标准精度的肽段对接(SP-Peptide)等功能，具体通过点击Schrödinger的Maestro对应的功能模块就可以快速实现这些复杂的流程；MM/GBSA是一种更精确的用于预测配体和受体结合自由能的方法，通过预测出的结合自由能进行药物分子的再排序能大大提升有效药物的富集率，具体可以通过Maestro图形界面的Prime模块来实现该功能。

蛋白质的晶体结构一般收录在PDB数据库(www.rcsb.org)中，由于蛋白受体表达和解析的原因，蛋白质往往会出现缺失氨基酸的现象，如果缺失的氨基酸在受体活性中心附近，那么将会影响药物虚拟筛选的精度，因此在做药物虚拟筛选的时候，要对蛋白受体进行残基补全的操作。Schrödinger提供了可视化蛋白处理图形界面Protein Preparation Wizard (如图2a所示)，处理蛋白受体结构一般分为三个部分，第一部分：“Import and Process”主要实现了两个功能，第一个功能是导入蛋白质文件，可以输入PDB ID通过互联网直接下载受体结构，也可以通过本地硬盘直接导入受体结构；第二个功能是处理受体的结构，它可以实现加氢、创建金属离子零级键和二硫键、硒代蛋氨酸转化为甲硫氨酸、补全缺失残基和loops区、删除水分子、对非氨基酸部分的分子进行pH滴定操作等(图2a)。第二部分：“Review and Modify”是对上一部分的检查和修整，如果有些共价键不合适或者出现原子重叠等现象，它会提示使用者进行相关的修改和优化操作。第三部分：“Refine”主要实现了对受体进一步优化的操作，它包含了2个功能，第一个是对受体进行pH滴定的操作(图2b)，具体pH的大小可以根据文献报道和PDB数据库提供的相关实验数值进行设定，这一部分操作是非常必要的，因为在受体活性中心的一些氨基酸可能有不同的质子化状态，如组氨酸存在四种不同的质子化状态(共轭中性形式N1H-His和N3H-His、阴离子形式His^-和阳离子形式HisH₂⁺)，滴定符合实验数值的氨基酸能提高虚拟筛选的精度；第二个功能是通过力场对受体的氢原子构象进行优化(图2c)，由于氢原子在分子对接过程中扮演着一个重要的角色，它能够跟氧和氮原子等形成氢键，对受体氢原子的优化也能够提高药物虚拟筛选的精度。

该过程可以让学生在电脑上进行规范操作，通过向学生提问每一步操作的理由，加深学生对受体结构处理的理解。

受体和配体处理完毕之后，还有一个比较重要的步骤是定义蛋白受体的活性口袋和产生用于虚拟筛选的格点文件，通常在做分子对接的时候，使用方盒子定义受体的活性中心(如图3所示)，具体步骤：打开“Receptor Grid Generation”窗口，点击在受体活性中心的配体就能自动生成对应的方盒子，同时也可以通过“Receptor”和“Site”进行手工调整受体活性中心的方盒子大小和位置；如果受体中没有配体分子，也可以使用文献中报道的关键氨基酸残基作为基准来确定受体活性口袋的位置和大小，“Constraints”可以在分子对接的过程中限定受体-配体之间的氢键作用等，“Rotatable Groups”用来定义受体柔性的残基，可以设定与配体分子有氢键相互作用的受体残基为可旋转基团(图3)，“Excluded Volumes”定义配体分子对接的禁区，最后点击Run按钮就可以产生用于药物虚拟筛选的格点文件。

从PDB数据库上下载不同的蛋白质受体，然后让学生根据学习的知识尝试调节受体活性口袋的大小和位置，通过对不同蛋白受体的操作练习，培养学生分析受体关键活性位点的技巧和能力。

上述过程对受体进行了处理，药物的虚拟筛选还需要对配体进行处理和过滤，配体的结构一般取自ZINC数据库(zinc.docking.org)。ZINC数据库中包含了超过3500万个可够买和用于分子对接的3D结构的药物小分子，构建有效药物过滤模型可以提高药物虚拟筛选的精度和效率。具体构建配体数据库的过滤步骤分为三步(如图4所示)：首先，构建ADME (吸收-absorption、分布-distribution、代谢-metabolism、排泄-excretion)的过滤流程，ADME反映了药物动力学的一些特征，一些筛选出的药物分子在细胞水平上有很好的药物活性和结合力，但是在生理环境下的吸收、分布、代谢和排泄上表现出很差的结果，前期的药物设计如果不注意这一点，就会浪费大量的时间和经费；通过ADME进行过滤，可以减少吸收代谢差等成药性差的分子，这一块主要由Schrödinger的QikProp模块来完成；其次，构建Lipinski’s Rule of Five即类药性五原则(分子量小于500道尔顿；氢键给体数目不超过5个；氢键受体数目不超过10个；脂水分配系数在−2到5之间；可旋转键的数量不超过10个)的过滤步骤，这一步可以充分论证待筛选的药物分子是否可以成药，从而减少一些非类药分子的干扰；最后，构建泛筛选干扰化合物(PAINS)的过滤模型，PAINS是指某些化合物表现出来的活性是假阳性，这些药物分子表现出的活性并不是基于蛋白质和小分子之间的特异性相互作用，它们往往形成类似聚合物的形式包围在受体靶点的周围，或者与受体靶点形成共价键从而导致假阳性的结果；对于真正的药物分子，它能够精确可逆地作用于蛋白受体的活性位点，从而抑制或激活蛋白受体。如果不进行PAINS的过滤，这会导致研究人员把PAINS当成有潜力的候选药物分子，进而为了优化这些假阳性化合物浪费很多时间和研究经费；这一步主要借助Schrödinger的模块来过滤掉有反应活性基团的药物分子。

在教学过程中，可以让学生使用Schrödinger的Virtual Screening Workflow (VSW)分别点击运行QikProp、Lipinski’s rule和Remove ligands with reactive functional groups模块来体验ADME、类药性五原则和PAINS的过滤。

准备好受体的格点文件和配体分子的数据集之后，就可以进行药物的虚拟筛选，第一步使用Schrödinger的VSW模块进行药物分子的ADME、Lipinski’s rule和PAINS过滤，第二步使用VSW提供的三种筛选流程进行筛选，即HTVS、SP和XP，相比之下HTVS筛选速度最快，针对待筛选的药物大数据，首先使用HTVS进行大规模的虚拟筛选，然后保留一定百分比的排名靠前的药物分子，如保留前20%的药物分子，这样HTVS筛选就把后续的工作量缩小了80%；其次，为了使筛选的结果更加精准，再使用Glide的SP计算模块对得到的结果进行标准精度的分子对接筛选，这一部分具体的实施步骤：对受体和配体复合物的能量优化、实施柔性的分子对接，为了在课堂上更好的演示，本步骤可以保留前10%的筛选结果，计算模块使用了如下形式的打分函数，如式(1)^[4]

(1) $\begin{array}{l}\Delta {G_{{\rm{bind}}}} = {C_{{\rm{lipo - lipo}}}}\sum {f({r_{{\rm{lr}}}})} + {C_{{\rm{hbond - neut - neut}}}}\sum {g(\Delta r)} h(\Delta \alpha ) + {C_{{\rm{hbond - neut - charged}}}}\sum {g(\Delta r)h} (\Delta \alpha ) + \\\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;{C_{{\rm{hbond - charged - charged}}}}\sum {g(\Delta r)h} (\Delta \alpha ) + {C_{{\rm{max - metal - ion}}}}\sum {f({r_{{\rm{lm}}}})} + {C_{{\rm{rotb}}}}{H_{{\rm{rotb}}}} + \\\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;{C_{{\rm{polar - phob}}}}{V_{{\rm{polar - phob}}}} + {C_{{\rm{coul}}}}{E_{{\rm{coul}}}} + {C_{{\rm{vdW}}}}{E_{{\rm{vdW}}}} + {\rm{solvation terms}}\end{array}$

这一部分的打分方式主要是基于ChemScore函数进行的；接下来，为了能够得到更精确的筛选结果，使用Glide的XP计算模块进行更精确的药物虚拟筛选，具体的实现步骤包括：对受体和配体复合物的能量优化、实施柔性的分子对接、保留三个小分子的构象用于下一步的研究，并选留前5%的筛选结果，这一步使用的打分函数如式(2)^[5]

(2) $\text{XP GScore}={{E}_{\text{coul}}}+{{E}_{\text{vdW}}}+{{E}_{\text{bind}}}+{{E}_{\text{penalty}}}$

XP GScore可以更好地预测蛋白和小分子的作用能，提升了精确药物筛选的富集率，但是根据相关文献报道^[2]，相比SP的分子对接，XP在计算精度上没有太大的优势，因此需要进一步提升药物筛选的精度；为了进行更精确的筛选，使用Epik模块对受体和配体分子进行滴定和优化，Epik模块对处于高能状态的对接结果进行处罚，进而提高虚拟筛选的精度，所以Docking Score是XP Score加上Epik状态罚分项。最后，在XP GScore的基础上，再进行MM/GBSA的优化排序，MM/GBSA是一个精度较高的评估小分子和生物大分子(蛋白质、核酸等)结合能力的方法，它可以弥补XP GScore的一些不足之处，具体的计算方法如式(3)：

(3) $\Delta {{G}_{\text{bind}}}={{E}_{\text{complex(minimized)}}}-[{{E}_{\text{ligand(minimized)}}}+{{E}_{\text{receptor(minimized)}}}]$

经过具体的实验测试：以肝细胞生长因子受体(c-Met)作为靶点，随机抽取ZINC数据库上的~10万个药物分子，并把靶向c-Met受体的FDA批准的药物分子crizotinib (ZINC ID: 35902489)掺入到待筛选的数据集中。通过上述步骤进行药物虚拟筛选，表1是选取的药物分子筛选结果，从表中可以发现crizotinib的XP Gscore和Docking Score结果比较靠后，而MM/GBSA计算出的结合能是最好的，因此MM/GBSA能提升有效药物分子的富集率。

这一部分可以在课堂上进行演示，并且选取少量的分子布置成家庭作业，让学生在自己的电脑上进行操作，比较使用不同打分函数的差别，从而深刻理解药物虚拟筛选的原理和应用。

Schrödinger提供了很友好的可视化操作界面，可以给学生在大学课堂上进行清晰的演示。在介绍完药物虚拟筛选的技术原理之后，可以使学生直观地看到受体的处理过程、药物分子过滤模型、高通量筛选、标准精度筛选、高精度筛选和MM/GBSA等；在具体的实验过程中，可以让学生比较使用不同的打分和筛选方法对结果的影响，使学生能够深刻理解药物虚拟筛选的原理和方法，对提升生物和化学信息学的教学质量有很好的示范意义。