仪器分析实验是化学专业本科生的基础课之一，也是其他相关专业重要的学科选修课之一。随着科学技术的不断进步，仪器分析发展十分迅速，新技术、新方法不断涌现，如何将新实验、新技术在课堂上及时授之于学生，是仪器分析实验教学中值得关注的课题。紫外-可见分光光度法实验是仪器分析实验课程中的重要组成部分，通过该实验，可系统地使学生掌握紫外-可见分光度法的原理、仪器结构和定量分析方法。传统的光度法是通过加入显色剂与待测物形成有色配合物而进行检测的，存在选择性不高、灵敏度低等不足。纳米材料因具有不同于常规材料的力学、热学、光学及化学活性等方面的特殊性能而备受关注，以纳米粒子为基础的比色检测方法，通过观察纳米粒子聚集或分散过程中颜色的改变，或借助紫外-可见分光光度计检测其吸光度的变化即可检测不同种类的物质如重金属离子、生物分子等，具有灵敏度高、选择性好、操作简单的优点。将纳米比色分析法引入到仪器分析的实验教学中，在实验过程中将分析化学研究领域的最新研究成果和发展动向引入授课内容，不仅可以使学生了解和掌握紫外-可见分光光度法的原理和实验技术，还能学习纳米材料的制备方法与应用，激发学生对科学研究的兴趣，提高学生的创新能力。

1)了解纳米比色法的基本原理及在分析检测方面的应用。

2)掌握纳米银的合成方法。

3)了解紫外-可见分分光光度计的性能、结构，掌握仪器基本操作方法。

4)熟悉绘制吸收曲线的方法，学会使用分析软件处理和分析实验数据。

左氧氟沙星(LFX)是一种广谱抗生素，因具有良好的抗菌活性，被广泛应用于治疗各种感染性疾病^[1]。然而由于超范围用药、超适应症用药和不合理用药导致了左氧氟沙星的滥用，并由此引起的不良反应时有发生^[2]。LFX经体内代谢后约有80%以原药的形式从尿液中排出，因此测定尿液中LFX的含量对监测抗生素残留、指导合理用药、保护人类生命健康有重要意义。测定LFX有多种方法，如紫外光谱法^{[3, 4]}、荧光光谱法^{[5, 6]}、高效液相色谱法^{[7, 8]}、毛细管电泳法^{[9, 10]}等，但这些方法有的需要大型精密仪器，对操作人员的要求较高；有的灵敏度较低；有的测定步骤繁琐复杂；不利于实现方便、快捷的检测。利用金/银等贵金属纳米粒子独特的光学性质建立起来的纳米比色检测法由于其灵敏度高、选择性好、操作简单，无须借助大型分析仪器，即时检测，结果可视化等优点，近年来逐渐引起人们的广泛关注，并应用于金属离子、蛋白质、农药、有机污染物的检测^[11-13]。

银纳米粒子拥有很强的表面等离子体吸收(SPR)，而且吸收波长与纳米粒子直径有着密切的关系，当特定待测物使得银纳米粒子聚集导致粒径增大时，离子共振吸收峰则会发生红移，宏观表现为肉眼可见的颜色发生改变，然后根据颜色变化实现对目标物的分析。然而，由于银纳米粒子本身表面能较高，非常容易发生团聚而导致它们性质的改变，因此需要加入保护剂来稳定溶液中的银纳米粒子^[14]。加入表面活性剂，如阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)可以起到稳定银纳米粒子的作用，并且可以提高检测性能^{[15, 16]}。本实验利用左氧氟沙星诱导SDS-AgNPs聚集变色现象建立了灵敏的测定左氧氟沙星含量的新方法，检测原理如图1所示，由加入LFX前后的SDS-AgNPs紫外-可见吸收光谱可见，当未加入LFX时，SDS-AgNPs的最大吸收波长为394 nm，并由于SPR的作用，SDS-AgNPs溶液表现出明黄色，表明成功合成了SDS-AgNPs ^[15]。而当加入LFX后，LFX引起了SDS-AgNPs的聚集，并随着LFX浓度的增加，吸收峰发生红移，其最大吸收波长从394 nm红移至405 nm，并且405 nm处的吸收逐渐下降，535 nm处的吸光度值逐渐增大，溶液颜色逐渐由明黄色变为棕黄色，最后变为红色。在优化条件下，SDS-AgNPs在535和405 nm处的吸光度比值(A₅₃₅/A₄₀₅)与加入的左氧氟沙星浓度呈正比，可通过紫外-可见分光光度计进行定量检测。

仪器：岛津UV2600紫外-可见分光光度计(日本，岛津)，Delta 320 pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，磁力搅拌器(上海恒勤仪器设备有限公司)。

试剂：左氧氟沙星标准品以及硝酸银、硼氢化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)等均为分析纯，购于国药集团化学试剂北京有限公司。实验中玻璃器皿均使用王水浸泡，超纯水洗净后烘干备用。

向10.0 mL 1.0 mmol·L⁻¹的AgNO₃加入1.0 mL的1.0 mmol·L⁻¹ SDS溶液，二者均匀混合之后逐滴加入到在冰浴中的30.0 mL新配制的2.0 mmol·L⁻¹ NaBH₄溶液中，避光搅拌10 min，得到明黄色的SDS-AgNPs溶液，然后将此溶液转移到100 mL的容量瓶中，定容后避光保存备用。

所有测定均在室温下进行。取SDS-AgNPs溶液950 μL于离心管中，加入准确配置的不同浓度的左氧氟沙星溶液50.0 μL，混合均匀，2 min后观察实验现象并记录该溶液的紫外-可见吸收光谱图。考查该方法的选择性时，准确配制浓度均为2.0 mmol·L^-1的葡萄糖、尿素、尿酸、NaCl、KNO₃、CaCl₂、Mg(NO₃)₂溶液，分别取上述溶液各50.0 μL加入到SDS-AgNPs中混合均匀，2 min后观察实验现象。尿样测定时取新鲜尿样2.0 mL，高速离心5 min后取上清液50.0 μL，按上述方法测定。

合成过程中加入阴离子表面活性剂SDS的目的是为了形成稳定的银纳米粒子分散溶液，由于静电吸引作用SDS在AgNPs表面自组装成单分子层，利用空间位阻效应阻止银纳米粒子的团聚，SDS的浓度大小将会影响AgNPs的稳定性和检测特性。实验固定AgNPs浓度为0.1 mmol·L⁻¹，变化SDS的浓度分别为0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.2和0.4 mmol·L⁻¹，考查了不同SDS浓度对AgNPs分散稳定性的影响和检测的灵敏度。当SDS与AgNPs的摩尔浓度比小于1 : 10时，AgNPs溶液不稳定，容易产生团聚生成黑色的沉淀。提高SDS浓度，则AgNPs稳定性增加，在避光处均可稳定保存一个月以上。而当SDS浓度较高时，其会阻碍AgNPs与左氧氟沙星的相互作用，不能引起AgNPs的聚集，使检测的灵敏度降低。如图2所示，当SDS与AgNPs的浓度比为1 : 10时，信噪比最大，且AgNPs能稳定存在，因此实验中SDS与AgNPs的最佳摩尔浓度比选择为1 : 10。

实验考查了不同反应时间(0−10 min)对测定结果的影响。当LFX加入到SDS-AgNPs溶液中，溶液立刻产生颜色的变化，吸光度值随着反应时间的增加而略有增大，当反应时间为2 min后，吸光度值达到稳定，为缩短分析时间，故反应时间选择为2 min。

考虑到实际尿样中可能存在的干扰物质如葡萄糖、尿酸及各种离子等对LFX测定的影响，实验在相同测定条件下分别加入10倍于LFX浓度的葡萄糖、尿素、尿酸、Cl⁻、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺，发现这些物质不会对测定产生干扰(图3)，只有加入LFX时才会引起SDS-AgNPs产生颜色的变化。

在最佳条件下，向SDS-AgNPs中加入不同浓度的LFX，结果如图4所示，在A₅₃₅/A₄₀₅处的吸光度比值与LFX浓度在0.20−24.0 μmol·L⁻¹范围内均具有良好的线性关系，线性回归方程为Y = 0.0292X +0.1138，线性相关系数为0.9958，检出限为0.11 μmol·L⁻¹，由肉眼观察到的最低检测浓度为2.0 μmol·L⁻¹。对浓度为10.0 μmol·L⁻¹的LFX标准溶液进行11次平行测定，测得其相对标准偏差为1.66%。

在优化条件下，对三种尿样进行了测定，均未检测到LFX。对空白尿样进行加标回收率测定，测得回收率在88.9%−107.8%间，相对标准偏差小于2.49%，结果如表1所示，说明该方法可用于尿液中LFX含量的测定。

采用化学还原法制备纳米银具有操作简单、重现性好、产率高的优点，但在操作过程中如果存在器皿不洁净、操作不当等问题亦会导致纳米银团聚，从而影响最终的实验结果。例如，玻璃容器表面存在的少量污染会导致瓶底或者液面上有黑色的团聚物生成，因此在实验过程中要注意玻璃器皿的清洁，玻璃器皿要经过酸洗、干燥处理，同时在反应过程中要注意避光。

纳米银比色法是一种基于纳米银粒子的表面等离子共振效应的光学检测技术。这种方法原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，并且实验结果用肉眼便可直接观测并可利用紫外-可见分光光度法测定，在分析化学、环境监控、生物检测等领域都具有广泛应用。该实验安排为4学时，每2人为一组，实验前让学生做好预习准备工作，通过查阅文献了解纳米银的合成与应用，并提前熟悉紫外-可见分光光度法的原理与使用方法，经教师指导便能独立操作。经过2个学期的实验教学，效果良好。纳米科技的发展给人们展现了神奇的纳米新世界，将纳米技术与传统的光度法教学相结合，更新紫外-可见分光光度法实验教学内容，通过合理的设计实验教学内容，不仅可以开阔学生的眼界，促使其紧跟科学发展步伐，还可以培养和提高学生的科研创新素质。