磷是重要的生命元素之一，对生命活动起着重要的调控作用。磷元素在自然界含量较为丰富，在地壳中的丰度排第11位，质量百分比约为0.12%。生物体内磷元素的含量更为丰富，人体组织中除去水后磷的质量百分比为1%，排在氧、氮、氢、碳和钙之后，位居第6。DNA中磷元素的含量更是高达9%。可以说，生命体实现了磷元素的有效富集。磷元素全方位参与着生命体的结构与功能：遗传信息的载体核酸分子富含磷酸二酯键，磷脂是生物膜的重要组成成分，生命的代谢过程高度依赖三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate, GTP)等磷酸核苷分子的参与，细胞中大约1/3的蛋白质都经过磷酸化修饰^[1]，细胞内蛋白质的可逆磷酸化修饰，调节着细胞内从信号转导、基因表达，到细胞周期的多种生命活动。正如诺贝尔奖获得者Todd L.教授所述“Where there’s life, there’s phosphorus”。

根据磷酸化蛋白质中磷酸基团所连接的氨基酸残基位点的不同，可以把它们分为四类：即O-磷酸化蛋白质(通过如丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸侧链羟基的磷酸化形成)，N-磷酸化蛋白质(通过如精氨酸/赖氨酸或组氨酸侧链官能团的磷酸化形成)，酰基磷酸化蛋白质(通过天冬氨酸或谷氨酸的侧链羧基的磷酸化形成)，S-磷酸化蛋白质(通过半胱氨酸的侧链巯基的磷酸化形成)。

20世纪80年代后期，课题组发明了在水与乙醇混合的溶剂中合成N-磷酰化氨基酸的简便方法，并应用于常见的20种氨基酸的N-磷酰化反应(图1) ^[2]。

在N-磷酰化氨基酸合成过程中还发现，当存在过量的磷酰化试剂时，在相同的条件下，反应体系中会有副产物N-磷酰化氨基酸酯、N-磷酰化二肽和N-磷酰化二肽酯生成。根据Lipmann F.提出的蛋白质的生物合成经过了羧酸磷酸混合酸酐的假设，我们课题组提出了上述副产物的生成机理，并受机理的启发，发展了利用磷酰化试剂作为羧基活化剂来合成N-保护二肽的方法^[3]。

在尝试合成各种N-磷酰化氨基酸的过程中，课题组的研究生们发现N-磷酰化的丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酸是五个特别活泼的磷酰化氨基酸，它们在温和的条件下(醇类溶剂中，40 ℃，数小时)就会发生明显的羧基的酯化反应、磷酰基的酯交换反应，以及磷酰基从N$ \to $O的迁移(即磷酰基由氨基端迁移到丝氨酸和苏氨酸的侧链羟基上)，或者磷酰基从N$ \to $S的迁移(由氨基端迁移到半胱氨酸的侧链巯基上)，尤为重要的是还会生成相当数量的磷酰化二肽或者磷酰化二肽酯^[4-7]。

通过³¹P NMR的跟踪反应，以及改变底物作为对照实验，我们认为N-磷酰化氨基酸形成的分子内五元环五配位磷混合酸酐结构(图2, Compound a)是上述反应能够进行的关键中间体^[8]。

在上述实验结果发表的同时，清华大学化学系组建的课题组开始对N-磷酰化氨基酸与DNA的相互作用进行初步探索。博士后沙耀武首先发现了多数N-磷酰化-L-氨基酸可以降解DNA，很快博士生尹应武提出，应当考虑到在水溶液中N-磷酰化-L-氨基酸容易水解，水解产物磷酸二酯或者磷酸单酯都有很强的酸性，在这种酸度下DNA主要是发生了酸性水解。因此，必须在缓冲溶液中进行DNA降解反应，而且要保证缓冲容量足够大，使反应混合溶液在降解过程中始终保持在中性。在课题组前期工作的基础上，实验室决定把N-磷酰化-L-丝氨酸和N-磷酰化-L-组氨酸等化学性质活泼的氨基酸作为研究重点。

博士生李永芳和博士后沙耀武^[9]主要研究N-磷酰化-L-组氨酸在柠檬酸盐缓冲体系中对DNA的作用，他们发现在37 ℃下保温72小时，上述体系能够切割λ DNA及质粒DNA。

硕士生麻远和博士生尹应武重点研究N-磷酰化-L-丝氨酸对DNA的降解反应。考虑到细胞内应该可以兼容氨基酸，在尹应武建议下采用了饱和的L-组氨酸溶液作为缓冲剂。N-磷酰化-L-丝氨酸透明的油状物，因为性质极其活泼，在实验室合成后，需要尽快将其配制成所需浓度的溶液，用饱和的L-组氨酸溶液作为缓冲体系，与适当浓度的DNA一起在37 ℃保温。

由于实验室一直从事有机合成，刚开始时不具备检测DNA的实验条件，最早的切割DNA实验是到中科院植物所林忠平研究员的实验室进行的，通过凝胶电泳检测DNA的变化。令人高兴的是在1993年春季的DNA切割条件的探索实验中，麻远在紫外灯下观察到了明确的λ DNA被降解的条带。不久清华化学系的实验室也购置了相应的仪器，具备了所需要的实验条件。但是，令人困惑的事情发生了，新合成的N-磷酰化-L-丝氨酸，在新鲜配制的饱和L-组氨酸溶液中，各种浓度下均对λ DNA及质粒DNA不再具有可观察到的降解切割现象。

首先我们的推断就是新合成的原料可能不够纯净。在更加精心地进行了N-磷酰化-L-丝氨酸的合成，并利用质谱与核磁确证其纯度后，又进行了数次重复试验，包括配制溶液所用双蒸水的纯度，以及溶液的尽快配制与保温反应，然而，紫外灯下仍然无法重现对DNA的切割现象。一次次的失望使研究生陷入了深深的困惑甚至焦虑中。大约在无解的黑暗中徘徊了一年多，由于不甘心，研究者在一边进行其他方面的课题研究时，一边还是想找到那次偶然成功的真正原因。

在某次翻阅实验记录本时，麻远突然注意到那次的溶液并非是新制的，而是在冰箱-20 ℃冷冻保存了大约三周后，才与DNA进行共同保温的。难道奥妙就在这里？并非是新鲜合成的纯净N-磷酰化-L-丝氨酸起作用，而是N-磷酰化-L-丝氨酸在饱和L-组氨酸溶液中放置一段时间发生了变化，才具备了降解DNA的功能。思路打开之后，立即对N-磷酰化-L-丝氨酸在饱和L-组氨酸中陈化一段时间的溶液进行质谱检测，确实有明显的L-丝氨酰-L-组氨酸二肽(丝组二肽)质谱峰信号。1996年，在成都召开的中国国际多肽会议(CPS96)上首次报道了该实验结果^[10]。

但还是需要用纯净的丝组二肽才能够验证这个推测。起初曾尝试合成丝组二肽，由于实验室没有固相合成多肽的原料和仪器，使用液相法的合成也不顺利，此时新的博士生李向红加入了团队，她从Sigma公司的试剂手册中发现竟然有商品化的丝组二肽出售，之后的实验一切顺理成章了。就是它，丝组二肽(图3)，能够在37 ℃降解λ DNA及质粒DNA。

2000年，与俄亥俄大学陈小茁实验室合作继续完成了一系列相关的实验之后，丝组二肽及其相关寡肽对DNA、蛋白质及羧酸酯的降解研究的全文正式发表^[11]。

生命体系重要的生物大分子除了核酸还有蛋白质。在前期研究基础上，厦门大学研究小组针对丝组二肽对蛋白质的降解活性、底物普适性、分子作用机制以及丝组二肽与丝氨酸蛋白水解酶的分子进化关系等进一步展开了系统的研究。

厦门大学公共卫生学院的夏宁邵教授从厦门海域的大型多管水母中获得一种能发出迷人的绿色荧光的蛋白质——GFPxm，具有独特的β-桶状结构，而且通过蛋白质一级序列的定点突变，还可以获得橙色荧光、红色荧光蛋白。突变体蛋白的荧光颜色改变，是因为定点突变引起荧光蛋白的二级结构的比例发生改变。2001年，因为夏宁邵老师友情相赠，厦门大学课题组的杜海莲博士后获得了美丽的绿色荧光蛋白及其各种突变体。她利用这种独特结构的蛋白质为底物，探讨丝组二肽对蛋白质的降解活性与蛋白质二级结构比例的关系，发现丝组二肽对绿色荧光蛋白及其各种突变体都具有降解活性，只是二级结构中α-helix的含量越低越容易被降解。与传统蛋白水解酶K的活性相比，丝组二肽的降解底物蛋白的活性是比较弱的，大约1 mmol丝组二肽与0.33 × 10^-4 mmol蛋白酶K的水解活性相当^[12]。

为了进一步探索丝组二肽对底物蛋白降解活性的普适性，厦门大学课题组刘艳、留筱厦、高祥等老师同学又针对亲环素A (CyPA)、GFPxm18、牛血清白蛋白(BSA)及肌红蛋白(Mb)展开研究，发现丝组二肽的降解活性具有相对广泛的底物蛋白普适性。通过比较丝组二肽对底物蛋白降解碎片的高分辨质谱分析结果，并与生物信息技术相结合，发现丝组二肽对底物蛋白的一级序列降解具有多样性，正好能够满足生命进化初期蛋白水解酶的最基本生物功能，即对异源蛋白的广泛降解以获取足够的营养物质积累。

多种天然蛋白酶的活性中心都含有两个关键氨基酸，即L-丝氨酸和L-组氨酸，它们相互协作，直接参与各种酶促反应。既然丝组二肽具有降解蛋白质的功能，那么丝组二肽与现代蛋白酶之间是否存在着由简单到复杂的分子进化关系？厦门大学研究小组的刘艳老师与厦门大学生命科学学院生物信息学专家纪志梁老师合作，以17种典型物种340种蛋白水解酶为基础，利用生物信息技术研究丝组二肽与丝氨酸蛋白水解酶的进化关系。研究发现，蛋白水解酶的降解活性专一性确实有个由简单多样性到复杂专一性的进化过程；并且，从低等到高等生物，它们的活性中心口袋都含有一致的Ser-[X]-His活性区域，甚至也观察到没有中间[X]氨基酸残基的活性区域。上面的研究结果进一步说明丝组二肽与现代蛋白酶之间存在着一定程度的由简单到复杂的分子进化关系^[13]。

我们知道蛋白酶具有“微观可逆性”，也就是蛋白酶既可以水解肽键，也可以催化肽键的生成。基于微观可逆原理，我们推测丝组二肽也应该具备这种功能可逆性。有意思的是，意大利的Luisi P. L.教授^[14]关注到了我们的关于丝组二肽的研究工作，并对丝组二肽的微观可逆性展开研究，发现丝组二肽确实能够催化肽键及肽核酸PNA的生成。2009年诺贝尔生理或医学奖获得者，哈佛大学医学院Szostak J. W.教授领导的研究团队^[15]利用丝组二肽催化肽键生成的功能，人工模拟原始细胞膜的生成。2013年，Wieczorek R.教授等^[16]也发现丝组二肽可以催化磷酸二酯键的生成。

丝组二肽是目前发现的具有多种生物酶活性功能的最小的功能肽。在结构上含有丝氨酸蛋白水解酶超家族三元催化中心的关键的两个氨基酸残基，即L-丝氨酸、L-组氨酸残基。在功能上，它不仅能够水解DNA，而且可以水解蛋白质及羧酸酯；对底物蛋白具有广泛的普适性，对底物蛋白一级序列的水解具有多样性，满足原始的简单降解消化功能；它具有功能的可逆性，既能够催化肽键、磷酸二酯键的水解，也能催化肽键、磷酸二酯键的生成。上述这些特点与现代酶极其相似，因此，有理由相信丝组二肽是迷你的磷酸酯酶和蛋白水解酶，是现代水解酶的分子进化原始雏形。

每一项科学研究的发现都是偶然性与必然性的结合。若没有实验室之前对磷酰化氨基酸性质的系统研究，对丝组这一简单二肽具有DNA、蛋白降解功能的发现时间很可能还要推迟，但是出乎意料的是在-20 ℃的条件下，N-磷酰化-L-丝氨酸仍然具有相当高的反应活性，能够与L-组氨基自组装成肽。磷元素在生命早期扮演的角色以及在生命长期演化过程中保留至今的重要生命有机化学反应和机理，仍然有许多未知环节等待着生物和化学家们去努力揭示。