21世纪是信息科学与生命科学高速发展的时代，培养具有创新能力和实践能力的大学生是当前科学技术高速发展带来的必然需求^[1]。目前，各大高校都在开展本科生科研训练计划，通过给予本科生项目一定的资金支持，鼓励本科生动手做实验并在导师指导下独立完成项目研究，培养学生的创新能力^[1-3]。在这样的背景下，我们三位大二本科生申请了一个科研训练项目并顺利完成，取得了较好的成绩，也收获了许多宝贵知识和经验。于此，我们将介绍整个科研训练项目的选题设计、实施以及答辩竞赛过程，期望能为其他指导本科生科研训练的导师提供借鉴意义，也可为其他对科研感兴趣的本科生提供一些宝贵的经验。

起初，我和另外两位大二本科生组成了一个项目小组，找到我院的林天然老师和侯丽老师想要做科研相关的创新实验，体验科研的乐趣。两位老师接受了我们进实验室做创新项目的申请。考虑到大二本科生还没有接触过科研训练，在项目之初老师先给我们两篇英文文献学习项目相关内容及原理等，并要求我们多来实验室，熟悉实验室的仪器操作，培养兴趣爱好。我们经过几个星期课余时间的研读，学习到了在人体中，碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)广泛存在于组织(例如骨、肾、肝等)中，在细胞信号转导、细胞分裂、分化、骨骼钙化等多种正常细胞功能中起着重要的作用^[4]。因此，检测血液中ALP含量具有重要意义。同时，我们也查阅了专利数据库，得知目前已公开检测ALP的相关专利中，一种检测ALP的液晶生物传感器及其制备方法(CN108375616A)，其液晶生物传感器需要使用偏光显微镜获得光学响应图像；一种基于碳点荧光“猝灭-恢复”的ALP的检测方法(CN106248644A)，需要使用荧光光谱仪获得荧光光谱图；用于检测ALP的修饰电极及制备方法与检测方法(CN107422014A)，需要利用电化学工作站获得电化学信号来绘制工作曲线。因此，现有的ALP活性检测方法主要借助荧光光谱仪、电化学工作站等分析仪器实现定量检测。然而，这些方法对操作人员要求较高的专业技能，特别是所使用的仪器价格较为昂贵且体积庞大，不利于广泛的应用和推广。

因此，本项目提出构建一种多功能金属有机框架(metal-organic frameworks，MOFs)比率荧光传感平台，开展血液中ALP的高灵敏和即时诊断新方法研究(图1)。具体方案是通过铜离子与2-氨基对苯二甲酸(ABDC)配位合成带有荧光的2-氨基铜金属有机框架材料(NH₂-Cu-MOF)，利用ALP的底物焦磷酸(pyrophosphoric acid，ppi)来抑制NH₂-Cu-MOF的催化活性，再利用生物酶ALP催化水解ppi，恢复NH₂-Cu-MOF的催化活性，从而催化邻苯二胺(OPD)氧化，产生荧光信号变化。最后，利用具有便携和便宜优点的智能设备如智能手机作为定量读出装置，实现ALP的便携式、多色变化、高分辨率的可视化检测，具有重要的现实意义。

确定好项目选题及方案设计后，我们制定了项目的阶段性计划，分为以下三个阶段：

(1) 2017.10–2018.3，多功能MOFs的合成及其催化性能的研究；

(2) 2018.4–2018.9，构建MOFs荧光传感平台及其实际样检测；

(3) 2018.10–2019.3，便携式ALP可视化传感平台的构建与应用。

通过制定计划可以提高我们对整体训练时间节点的把握，提高训练效率。同时，我们在平时训练中轮流抽出空余时间做实验，并经常相互沟通交流实验进展。

硝酸铜(Cu(NO₃)₂·3H₂O)、无水乙醇(C₂H₅OH)、焦磷酸钠(Na₄P₂O₇·10H₂O)、盐酸(HCl)购买于西陇股份有限公司。2-氨基对苯二酸(ABDC)购买于Alfa Aesar。N, N-二甲基甲酰胺(DMF)购买于GENRAL-REAGENT。1, 2-苯二胺(OPD)购买于九鼎化学。三羟甲基氨基甲烷(Tris)购买于阿拉丁。钒酸钠(Na₃VO₄)购于麦克林。葡萄糖氧化酶、蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、胆固醇氧化酶、酪氨酸酶、核糖核酸酶A、溶菌酶、尿酸酶购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。以上所用的试剂级别至少是分析纯，且没有经过任何的纯化。实验中用到的水是经过Millipore系统纯化后的去离子水。

首先，将2 g Cu(NO₃)₂·3H₂O溶解在含有20 mL的去离子水。随后，将溶解有0.8 g 2-氨基对苯二甲酸(ABDC)的20 mL DMF和20 mL乙醇混合溶液加入上述溶液中。充分混匀后，将溶液转移至特氟隆衬里的高压釜中反应24 h。最后，通过离心收集NH₂-Cu-MOF沉淀，并用DMF、乙醇和去离子水洗后自然烘干。

ALP解除ppi对NH₂-Cu-MOF抑制的实验步骤：67 μL ppi (30 mmol·L^-1)、30 μL ALP (1.51 U·mL^-1)加入到283 μL pH 7.2的Tris-HCl缓冲液中，37 ℃孵育30 min，然后加入40 μL NH₂-Cu-MOF (0.25 mg·mL^-1)和80 μL OPD (0.4 mmol·L^-1)，37 ℃孵育1 h。在紫外灯下拍照并对图片进行信息提取与处理。

项目首要任务就是合成带有荧光发射功能的MOFs。我们一开始通过查阅文献，寻找可能适合本项目的材料。最先选择并合成了Co-MOF材料，然后在进行可行性分析时，发现Co-MOF虽然表现出氧化酶活性，但并不能被焦磷酸根或者磷酸根等抑制住催化活性，经过多次调整尝试后无果，故换成Ce-MOF再继续检测它的可行性，即是否能解除ALP对焦磷酸盐与Ce-MOF的超强结合作用，恢复Ce-MOF对邻苯二胺的催化氧化作用。而后发现Ce-MOF激发后呈现出的红色荧光对显色剂邻苯二胺(OPD)被氧化显现出来的黄色荧光会有较大的干扰。多次尝试Ce-MOF和OPD的含量比例后发现Ce-MOF的红色荧光对体系的干扰还是较大。

后来偶然发现Cu-MOF符合可行性，但Cu-MOF在紫外线下不显荧光，需要加荧光试剂。材料和荧光试剂的比例需要去调整，也不能确定添加的荧光试剂是否会对体系中的其他试剂造成干扰，所以设想是否可以将Cu-MOF中的Cu²⁺配位上一个显色的荧光基团使其带荧光。在尝试合成Cu-MOF的时候将配体对苯二甲酸换成带荧光基团的2-氨基对苯二甲酸，合成了NH₂-Cu-MOF。发现这个具有一定形貌特征的NH₂-Cu-MOF材料能够通过磷酸酶底物ppi来抑制NH₂-Cu-MOF的催化活性，再利用ALP解除ppi的抑制，恢复MOFs的催化活性，使得不同活力大小的ALP溶液在紫外光照射下呈现出不同程度的黄色荧光，从而实现荧光可视化检测ALP。

选定好NH₂-Cu-MOF作为ALP定量检测的荧光探针之后就需要构建基于NH₂-Cu-MOF的荧光传感平台。采用控制变量法对构建荧光传感平台的条件进行优化。初步设想是通过荧光仪检测荧光程度，以变量为横坐标，荧光强度为纵坐标优化实验条件并且实现定量检测。在实验中，发现NH₂-Cu-MOF氧化OPD溶液后的荧光强度与NH₂-Cu-MOF本体荧光强度差别较大，不能平衡这二者的强度，用荧光仪检测达不到较好的效果。在实验陷入难题的时候，考虑到NH₂-Cu-MOF溶液的蓝色荧光及NH₂-Cu-MOF和OPD混合液孵育后呈现的黄色荧光，以及不同比例的蓝色和黄色荧光复合而成的混合色，或许可以利用颜色的不同即RGB值作为纵坐标进行定量检测。

因此，我们尝试对孵育液在紫外光下显荧光后拍照，将照片传输到电脑中用Color Schemer Studio读出R值、G值、B值，再用表格收集并处理数据后，将数据用Origin 8处理成数据图。发现不同ALP浓度的孵育液的ΔR/(R+ G + B)值具有很好的差异性。因此，我们就改成以ALP浓度为横坐标，ΔR/(R+ G + B)值为纵坐标，构建浓度响应关系。

以体系的pH为例，设置梯度的pH进行优化(图2a)。发现随着pH的上升，孵育液的ΔR/(R+ G + B)值逐渐增加，到pH7.2时达到顶峰，而后pH再增加ΔR/(R+ G + B)值就逐渐减小，因此条件优化都使用pH7.2进行实验。再以温度优化为例，设置梯度温度(图2b)。发现从30到37 ℃ ΔR/(R+ G + B)值增加，而后温度再增加时发现ΔR/(R+ G + B)值又逐渐减小，因此最佳孵育温度设为37 ℃。按照这种优化条件的方法和模式，我们优化出了OPD的浓度、ppi的浓度、ALP的浓度、孵育时间等孵育条件。而后继续对荧光传感平台的选择性测定和抑制实验做了研究，发现利用ΔR/(R+ G + B)的比值法同样可以用于这些研究目的，最终将该方法用于检测实际样，取得了较好的回收率。

在整理出孵育条件数据和实际样数据后，开始设想是否可以将这种检测方法做成一种更加实用且便携的产品，能够应用到实际生活的血清检验中。因此，我们尝试用滤纸或者凝胶当运载材料的载体去检测ALP。滤纸本身含有荧光剂，在紫外光下呈蓝色。在数次的条件调整下，滤纸表现出的检测能力始终无法达到一个很好的效果，所以我们放弃使用滤纸，改尝试凝胶。

网状结构的琼脂糖水凝胶在理论上是可以作为NH₂-Cu-MOF的载体，且冷却后的琼脂糖水凝胶溶液是可以吸附在宏观物体上的，因此我们将NH₂-Cu-MOF分散在琼脂糖水凝胶网状结构的空隙中，再将混合液加到1.5 mL的离心管管盖中，冷却，制得凝胶管，再用此管去检测血清中的ALP活力。在重新采集血清并检测后，发现凝胶管检测血清的ALP回收率控制在98.0%–100.5%之间。因此，我们成功制得一种便携式血清ALP可视化检测管。

解决了血清ALP在检测时的便携性，但同时也存在着数据处理方面的繁琐性，具体来说就是数据处理需要手机相机和电脑中的三个软件承担不同的责任才能处理出数据图，程序虽然固定但较为繁琐，需要用到电脑之类的仪器。现阶段我们既然已经得出了体系中ΔR/(R+ G + B)值关于ALP活力的函数，是否可以输入手机软件程序中，只用手机就能实现对血清ALP的定量检测呢？抱着这样的猜想，我们开始寻求外院合作。很快在多次交流和沟通下，我们成功研发出一款在紫外灯下可对孵育后的检测管成像并集成化分析检测血清ALP活力值的手机软件(图3)。

打开手机APP，封面上方是人体血清样品拥有者的性别及年龄的选择，不同性别、不同年龄段ALP的标准值都不一样。性别和年龄段决定着求ALP值后弹出的数值框中的关联词。中间的两个入口分别是“碱性磷酸酶检测”和“其他生物标志物”。未来我们将会将该体系应用到其他生物标志物的检测，实现项目成果的普及和推广。

本项目提供了一种基于NH₂-Cu-MOF材料荧光可视化检测血清中ALP的方法。该方法不需要昂贵的仪器设备，而是利用具有照相功能的便携式手机作为检测器；无需专业人员操作即可通过凝胶管在紫外灯照射下颜色的变化分析ALP的活力大小，通过手机软件读取RGB数值可以实现对血清中ALP的现场可视化多色荧光定量检测。本项目开发了一款名为“生物标志物检测器”手机APP——在紫外灯下可对孵育后的反应液成像并集成化便携式检测血清ALP活力值的手机软件。主要步骤为进行拍照、取点后直接可以得出人体血清样品中碱性磷酸酶活力值。凝胶管和新手机软件的研发都为血液中ALP的床边即时检测提供了新方法，对于临床疾病的诊断和ALP在生理和病理过程中作用的研究具有重要的研究价值。

本项目获得2018年区级大学生创新创业训练计划的支持，且在一年后的结题答辩中验收良好。在项目开展的半年时间里，凝胶管的制作和应用已经完善，因此对其进行专利申请。2019年初，专利申请也已经进入实审阶段。在2018年秋季学期，参与本校“创新杯”大学生学术科技竞赛，在314份作品中获得了自然科学类的金奖；在2019年春季学期，被推荐参与第九届挑战杯——广西大学生课外学术科技作品竞赛，在646件作品中获得自然科学类的特等奖；在2019年秋季学期，参加第十六届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛，在1515份作品中获得自然科学类的三等奖。同时本项目成果也成功于2019年8月在Biosensors and Bioelectronics期刊(即时影响因子9.518)发表^[5]。

科技水平影响民族兴衰，创新能力关乎国家命运^[6]！作为当代大学生，我们现在所处的时期正是国家发展有理想、有本领、有担当的新时代有志青年的好时期。在项目开展的这段时间，我们学会了勇于改变现状、勇于创新、勇于实践的宝贵精神。

大胆的尝试或许已相当于成功的一半。在项目开始的时候，我们是抱着尝试的心态去参与学院的大学生创新创业训练计划申报竞争。当时需要从41份申报作品中筛选出大约20份作品，淘汰率接近50%。对于之前从未接触过科研的我，这样的竞争压力无疑是巨大的。那次大胆的尝试成为了我们漫长的答辩以及实验优化的道路的开端。以前的我自卑，觉得自己的项目不如其他的项目好，认为自己展示和回答的部分都不如我的竞争对手们。这个时候两位导师给予了我们很大的支撑力：一是理论支撑，两位导师在我们阅读完与项目相关的文献后，向我们讲述了很多关于抗原、抗体和检测原理的基础知识，使我们更好地理解了本项目的设计原理和设计意图；二是精神支撑，两位导师也劝导我们，面对竞争压力，不要一直想着一定要得到，而是想着一定要尽力，尽力之后就算得不到也不会留下遗憾。人生，从来都不是一帆风顺的。在项目成功拿到大学生创新创业计划训练项目的时候，我们心中不是被喜悦填满，更多的是去思考怎样可以更快地阅读文献增长知识和如何在一年内顺利结题的要求下把项目做得更好。项目的整个开展过程中充满机遇的同时也充满着未知的难题和转折。在选择合适的MOFs的时候经历了很多困难。项目大概停滞在这里有两三个月。而后虽然发现NH₂-Cu-MOF满足可行性，却一直无法像初步计划那样用荧光仪去达到一个很好的检测效果。在这些问题的解决过程当中，我们也慢慢地学会了变通，遇到障碍，不是一味执着，也不是一味沮丧，而应该是换种思维去考虑，这次失败的尝试让你知道了这条路是行不通的，那么就可以去寻找另外一条路。

人生也是一个充满着奇思妙想的旅程。结合NH₂-Cu-MOF与OPD显色的灵敏度使得该体系具有肉眼可视化的特点，利用解析显色的RGB值去进行定量检测。这种方法也被证实应用于血清ALP有出乎意料的效果。同时我们利用琼脂糖水凝胶作为视觉检测平台设计了一种便携式血清ALP可视化检测管，方便了定量检测前的实验步骤；开发了“生物标志物检测器”手机APP也方便了实验数据的处理和分析。这些成果可以说是一连串的设想、试验和改进。我们也从中领悟了科研的真谛，即能够有效地服务人类的各种实际生产生活活动，比如我们将该项目成果，集成化为常用的手机APP与凝胶测试管，有望应用到实际生活中血清ALP的检测，提高本项目的适用性。

本项目除了实验部分，最大的特色就是比赛部分。谁也不曾想到以前的一个试一试的心态会获得现在的成果。在项目开始的第一个暑假，我们项目的三位同学都留校继续开展项目。由于时间长度以及连续性，项目在这个时候有了很大的进展。而后在开学的时候，学校下发了关于举办学术竞赛也就是创新杯的消息。在我的观点里，创新杯这个比赛的主要目的是为了激发当代大学生的创新精神和实践意识，丰富校园生活。在大学，不应该虚度时光、碌碌无为，应该多参加活动比赛来充实自己、锻炼自己。这个消息让我开始在设想：既然都做出了一些成果，为何不去参加呢？和导师说了我的想法之后，导师们也是非常赞同我们去尝试的。所以我们开始紧锣密鼓地准备数据的整理以及文章的撰写。那个时候是项目最繁忙最累的时候，由于没有经验，也为了更加高效，我们选择分任务去完成这篇成果汇报。

在院级创新杯正式比赛的那个晚上我非常地紧张，即使已经在正式答辩前排练了很多遍，但依旧害怕自己说错或者卡壳忘词。我尝试换个角度去思考：努力不一定有成果，但不努力就一定不会有成果。最终我们的项目在院级创新杯中获得了较好的成绩，并被推选到校级创新杯决赛，在比赛抽签环节，我抽到了第二个答辩顺序。在大家的观念中普遍认为越前面答辩展演就越容易被遗忘，或者由于前面没有项目可以对比，而导致分数不高。在答辩全部结束之后、宣布答辩成绩之前，我一直在后悔自己为什么抽到第二个答辩、为什么刚才展示项目的时候不再流畅一点。还好事实证明，只要项目好，答辩顺序就不会影响到项目成绩。在之后的区级挑战杯中，我在答辩的时候变得更加地从容。挑战杯国赛三等奖并非一步登天，而是我们从院赛、校赛、区赛再到国赛，期间正式答辩至少6次，排练若干次，准备材料无数份得到的。一次次的锻炼也让我提高了自信心，不要总是把自己的能力想的那么差劲，不要总是自我否定，不要放大客观因素的影响力，相信自己也可以取得好的项目成果。

有信念、有梦想、有奋斗、有奉献的人生，才是有意义的人生，在本项目的实施过程中学到的这些都将是会影响我们一辈子的收获。

通过这次科研训练项目和一次次的比赛，大大增强了我们的科研创新能力和自信心。回想起这一历程，我总结了一些成功的经验，分享给对科研感兴趣的本科生。其一，要有自信心，相信自己作为本科生也可以做出优秀的科研成果，尽管我们可能没有研究生那么完善的知识理论体系，但是有经验丰富的导师进行指导和设备齐全的科研平台作为后盾，一切皆有可能；其二，要有良好团队合作精神，我和队友一共三人参与了本次科研训练项目，平时课时很多，根本没有一个大家都可以集中的时间做实验，团队三人都是将零散时间组合起来做实验，以保证项目的顺利实施；其三，要巧妙地结合交叉学科的优势，我们只有化学基础知识背景，但是对于电子产品应用软件的设计真是一窍不通，感到无能为力。在导师的指点下，我去找了一个电子工程学院的师弟，并且跟他沟通了手机APP的设计理念，功夫不负有心人，我们成功设计出了这款“生物标志物检测器”手机APP；其四，要有持之以恒的决心，我们在做实验的过程中，会不断遇到一些问题，但都通过自己一次次改变实验条件摸索最佳实验方案，才会顺利完成项目的结题。所以遇到困难和挫折不要气馁，要有迎难而上的决心，最终会得到满意的结果。