化学生物学实验是许多化学专业本科生的必修课程之一^{[1, 2]}。与有机化学实验、无机化学实验、材料化学实验等基础实验课程相比，化学生物学实验因其主要研究对象是生物分子，样品制备存在操作步骤多、耗时长、原理抽象等特点。如何在有限的课时安排下，既保证实验教学效果，又提高教学效率，全面发展学生的知行能力，是化学生物学实验教学面临的重要挑战。虚拟仿真技术以计算机模拟技术为基础，将仪器结构、实验过程与工作原理等以人机交互的方式呈现，是实现“互联网+化学”的一种新型表达形式。虚拟仿真实验既可以弥补传统实验教学在空间、时间、实验条件等方面的缺憾，又可以对传统实验进行延伸和补充^{[3, 4]}。但是，虚拟实验在培养学生动手能力和分析解决问题能力方面又存在局限性。为此，本文针对本科生化学生物学综合实验“金属β-内酰胺酶L1的表达和动力学表征”，对原实验教学内容与教学方式进行了创新性改进，探索了线上线下混合教学模式在该实验教学中的应用^[5]。

抗生素能够有效治疗细菌感染，然而抗生素的滥用加快了细菌耐药性的发展，给人类健康带来极大威胁^[6]。中国每年有7亿人次的细菌感染患者，抗生素的滥用比例高达80%。到2050年，全世界因抗生素耐药性而死亡的人数预测将会超过癌症，成为威胁人类生命健康的头号杀手^[7]。β-内酰胺类抗生素作为历史最悠久、使用范围最广、临床最常使用的抗生素之一，其耐药问题日趋严重^[8]。β-内酰胺酶诱导抗生素水解失活是细菌耐药性发生的一种重要机制^[9]。因此，开展β-内酰胺酶的动力学表征实验教学，对于学生深入了解β-内酰胺酶的作用机理，认识和关注抗生素耐药性问题具有重要意义。

L1酶的制备是动力学表征的前提，但是常规制备实验包括基因扩增、PCR产物的分析与纯化、重组质粒的构建、质粒转化、阳性克隆筛选、细菌扩大培养、蛋白质的诱导表达、纯化与鉴定等10余个环节，存在步骤复杂、耗时长(1周)、概念抽象等问题，给实际教学安排和学习带来挑战。鉴于此，本项目针对现有综合性教学实验“金属β-内酰胺酶L1的表达和动力学表征”进行改进，通过线上线下混合教学模式开展实验教学。改进内容包括：(1) 课前通过虚拟仿真实验线上学习L1酶的制备和动力学表征全过程及实验原理，以打破时空限制，在有限的课时安排下为学生构建完整知识体系，提高学习效率。(2) 课中有选择性地进行重点实验操作及拓展实验，提高学生的动手能力和创新思维。重点实验包括：重组蛋白AKTA纯化、目标蛋白的SDS-PAGE分析、和紫外-可见分光光度法表征酶活。此外，本项目将教师的科研成果转化为教学实验^{[10, 11]}，新引入等温滴定微量热法(ITC)表征酶活实验内容进行拓展实验，引导学生通过和紫外-可见分光光度法进行比较，加深对于两种方法优缺点的认识，培养学生的创新思维。线上-线下相结合、虚拟-实践相结合、科研-教学相结合的实验教学新模式在该实验中取得了良好的教学效果。

(1) 线上虚拟仿真实验。

本实验以虚拟仿真技术和微信平台为依托，构建集3D仿真、创新设计、全过程在线跟踪记录、考核评价、教学管理和数据分析于一体的移动虚拟实验教学平台。通过线上虚拟实验操作，真实还原重组蛋白质的制备过程，包括外源基因扩增、PCR产物的分析与纯化鉴定、重组质粒的构建、重组质粒转化感受态细胞、单克隆菌株的活化、细菌扩大培养、蛋白质的诱导表达等实验。同时采用微信平台一站式管理学习和考核，实现实验教学的信息化、网络化。

(2) 线下等温滴定微量热法表征酶活拓展实验。

金属β-内酰胺酶L1催化水解青霉素反应是一类重要的酶促反应。进行金属β-内酰胺酶L1催化底物水解反应的动力学常数K_M、k_cat的测定，不仅可以了解金属β-内酰胺酶L1的催化活性，而且为寻找新型抑制剂对抗细菌耐药性发展提供了理论和实践基础。由于任何酶促化学反应都伴有一定的热量吸收或释放，并且热量的变化速率和酶催化速率成正比，因而可以采用等温滴定微量热仪(ITC)通过检测酶催化底物反应过程中产生的实时热量变化来计算酶催化反应的速率。

其中，单位时间的热量变化定义为热功率：

$ \text { Power }=\mathrm{d} Q / \mathrm{d} t $

Todd和Gomez ^[12]给出了n摩尔底物转化为产物的热量计算公式：

$ Q=n \Delta H_{\text {app }}=[P]_{\text {total }} \cdot V \cdot \Delta H_{\text {app }} $

这里ΔH_app是反应的总表观摩尔焓变，[P]_total是生成的产物浓度，V是ITC滴定池的体积。由酶催化底物转化为产物过程中产生的热量为：

$\text { Power }=\mathrm{d} Q / \mathrm{d} t=\left(\mathrm{d}[P]_{\text {total }} / \mathrm{d} t\right) \cdot V \cdot \Delta H_{\text {app }}$

其中d[P]_total/dt等于反应速率，改写方程得到反应速率v = d[P]/dt = [1/(V·ΔH_app)]·(dQ/dt)。经量热仪提供的Origin程序对数据进行处理，对底物浓度和初速率进行米氏方程拟合，求得动力学参数v_max和K_M。

$ v=\frac{v_{\max }[\mathrm{S}]}{K_{\mathrm{M}}+[\mathrm{S}]}=\frac{k_{\mathrm{cat}}[\mathrm{E}]_{\mathrm{tot}}[\mathrm{S}]}{K_{\mathrm{M}}+[\mathrm{S}]}$

式中，v为初速率，[S]为底物浓度，v_max为最大反应速率，K_M为米氏常数。

三(羟甲基)氨基甲烷(Tris，C₄H₁₁NO₃，M = 121.14 g·mol⁻¹)，头孢唑啉钠盐(C₁₄H₁₃N₈NaO₄S₃，M = 476.48 g·mol⁻¹)，青霉素G钠盐(C₁₆H₁₇N₂NaO₄S，M = 356.37 g·mol⁻¹)，浓盐酸(HCl)，以上试剂均为分析纯。L1型金属β-内酰胺酶溶液(实验室自制，纯度 > 95%)。

移动设备(手机或Pad)或计算机，《金属β-内酰胺酶L1的表达及动力学表征虚拟仿真实验》软件(西北大学)，MLabs移动虚拟实验室APP (慕乐网络科技(大连)有限公司)，电子天平，紫外分光光度计，pH计，循环水式多用真空泵，移液枪，离心机，等温滴定微量热仪ITC 200 (美国马尔文仪器有限公司)。

(1) 用手机微信关注Moolsnet微信公众号，进行注册和身份认证。

(2) 使用手机下载MLab软件。

(3) 进入APP登录界面，点击练习模式图标，载入“金属β-内酰胺酶L1的表达虚拟仿真实验”，按照提示完成实验操作。

(4) 熟悉实验流程及操作细节后，返回页面主界面，点击考试模式，对学习情况进行检验。

(5) 考试完成后，可在主界面点击左上角记录本样图标查看成绩及历史记录。

(1) 溶液配制。

① 缓冲液配制：称量Tris碱配制50 mmol·L⁻¹ Tris，pH = 7.5的缓冲液，经0.22 μm硝化纤维素膜过滤后超声脱气。

② 抗生素的准备：用上述缓冲液配制1.5 mmol·L⁻¹青霉素G溶液(称量1 mg青霉素G溶于1.871 mL缓冲液中)和13 mmol·L⁻¹头孢唑林溶液(称量5 mg头孢唑林溶于0.807 mL缓冲液中)。

③ 蛋白溶液的准备：采用紫外分光光度计，选择波长280 nm测定L1酶溶液的吸光度A_L1，记录实验数据。根据朗伯比尔定律计算酶溶液的浓度A = εbc (ε_L1 = 54614 mol⁻¹·L·cm⁻¹；b为测量时的光程，单位为cm)，将L1酶溶液的吸光度A_L1代入即可求得L1酶溶液摩尔浓度。随后用50 mmol·L⁻¹ Tris pH 7.0缓冲液对其稀释至20 nmol·L⁻¹备用。

(2) 等温滴定微量热实验。

将L1型金属β-内酰胺酶溶液加入样品池(样品池体积为210 μL)，抗生素溶液(13 mmol·L⁻¹头孢唑林或者1.5 mmol·L⁻¹青霉素G)加入滴定针中，设定程序开始滴定实验(滴定体积30 μL，转速750 r·min⁻¹，25 ℃)并通过仪器实时记录反应过程中热量随时间的变化曲线，即反应的热谱曲线图，直至其回到基线时停止实验。参比池为超纯水。数据分析采用仪器自带Origin软件进行，通过积分热谱曲线的峰面积可以获得反应的表观焓变ΔH_app，并通过软件中酶催化动力学分析模式获得酶促反应的动力学参数K_M及k_cat。

本虚拟实验共设十个关卡，包括：外源基因扩增、PCR产物的分析与纯化鉴定、重组质粒的构建(酶切–纯化–连接)、重组质粒转化感受态细胞、单克隆菌株的活化、细菌扩大培养、蛋白质的诱导表达、紫外法表征酶催化动力学参数。每个关卡可独立运行，操作界面还提供文字提示、闪烁提示、实验原理提示、在线提问等辅助功能，保证学生能够根据提示独立完成实验操作。完成十个关卡实验操作大约需要60 min，通关后成绩自动上传。线上实验内容关键场景及仪器均以实物为原型，仿真设备包括：PCR扩增仪、超净工作台、恒温培养箱、凝胶电泳仪、紫外切胶仪、紫外-可见分光光度计、电子天平、恒温震荡摇床、集热式恒温加热水浴锅等(图 1)。实验参数及反应过程也高度还原真实情况，提供高度沉浸感实验体验。

在实验教学中，了解仪器的工作原理是十分重要的内容之一。本项目针对实验中抽象的实验原理进行虚拟仿真建设，以丰富的原创性Flash动画实现对抽象教学内容的直观展示，加深了学生对抽象原理的理解。如图 2所示，“PCR反应原理视频”展示了随着“变性–退火–延伸”试管中微观世界所发生的变化。再如琼脂糖凝胶电泳环节，电泳开始后学生会观察到不同分子量核酸条带随时间在凝胶上发生的位置变化，短DNA片段迁移较快，长DNA片段迁移较慢。加深了学生对于实验原理的理解，提高了学习的积极性与学习效果。

线下实验内容包括：重组蛋白AKTA纯化，目标蛋白的SDS-PAGE分析，紫外-可见分光光度法表征酶活，和新增加的ITC法表征酶活。ITC实验是对原紫外-可见分光光度法的拓展。青霉素G滴定L1酶的ITC热谱曲线如图 3所示，滴定过程伴随负热功率变化(峰型向下)，说明抗生素的酶促水解反应是放热反应，随着底物消耗其浓度降低，水解反应所产生的热量变化也逐步减少，直至反应进行到底物水解完全，热谱曲线回至基线。对热谱图峰面积进行积分可得反应的表观焓变(ΔH_app)。在Tris pH = 7.0的缓冲体系中，L1水解青霉素G钠盐和头孢唑林的ΔH_app分别是−26和−25 kcal·mol⁻¹ (1 kcal·mol⁻¹ = 4.186 kJ·mol⁻¹)，说明两种抗生素酶促水解过程的焓变相似。采用Origin软件对ITC热谱数据进行米氏曲线拟合，可得水解青霉素G的动力学参数k_cat = 192 s⁻¹，头孢唑林k_cat = 67 s⁻¹。比较两种抗生素的动力学数据表明L1对青霉素G的催化效率(k_cat/K_M = 3.5 s⁻¹·µmol⁻¹·L)高于头孢唑林(k_cat/K_M = 0.3 s⁻¹·µmol⁻¹·L)。该实验既丰富了原实验内容，加深了学生对于酶促反应热动力学知识的理解，又能引发学生对量热法和分光光度法进行比较，提高学生的分析判断能力和创新思维能力。

与原有实验对比(表 1)，改进后的实验在内容上新增了线上虚拟仿真实验和线下等温滴定微量热法表征酶活实验。从课时安排上新旧实验差别不大，但是新实验在内容上更丰富。实验教学流程如图 4所示。课前，学生在Moolsnet微信公众号在线预约实验，自行安排时间在虚拟仿真实验平台进行实验操作。完成线上虚拟实验后，学生需要进行在线考试，通过后才能进行线下实验。课中，在实验室开展线下实验，重点实验旨在锻炼学生的动手操作能力和分析解决问题的能力，拓展实验旨在培养学生的创新思维。同时在课中，学生就线上实验中遇到的疑点、难点与教师进行沟通与讨论。课后，学生需在微信平台提交电子实验报告。课程签到、预约、提交、成绩评定等均在微信平台进行，一站式管理实验教学与考核，既提高了学生的学习效率，也提高了教师的工作效率。

目前该线上线下混合实验已连续三年在本科实验教学中顺利开展，共服务200余名学生。为了进一步加强教学研究，我们对该课程开展了连续的问卷调查和反馈活动。课程满意度调查了2017级72名和2018级79名学生，结果显示86%的学生对“线上线下混合实验”模式表示非常满意，10%的学生表示比较满意，3%的学生表示一般，仅1%的学生表示比较不满意(图 5)。总体教学反馈良好。持支持意见的主要原因包括：(1) 教学形式新颖、趣味性强；(2) 虚拟实验清晰直观，场景逼真，体验感好；(3) 节省了实验时间和等待时间；(4) 虚拟实验更好地展示了实验细节及抽象原理；(5) 实验的连贯性和整体性更好；(6) 可以反复操作实验；(7) 虚拟实验打破了空间限制。持反对意见的原因包括：(1) 虚拟实验节奏较快，大多是机械操作，学生缺少思考；(2) 有些过程过于简化；(3) 不适应；(4) 实验结果千篇一律，不能从数据中发现问题。一部分受访同学表示虚拟仿真实验是一种创新的教学方式和新颖的学习体验，值得肯定和推广，但它与实际实验操作仍然存在差距，若能丰富实验现象的变化，增设错误选项必将会拉近其与真实实验的距离。因此，未来团队将进一步落实虚拟实验平台的提升，探索最大化发挥虚拟仿真软件对线下实验的辅助作用，提升实验教学质量。

本实验在原有化学生物学综合实验“金属β-内酰胺酶L1的表达和动力学表征”基础上进行创新。一方面引入了仿真虚拟实验环节，不仅有效解决了实验周期过长的问题，还增加了实验趣味性和可重复性。集中连贯的实验教学使知识构架更清晰、更完整。“时时能学，处处可学”的教学模式使学习、互动和考核不受时空限制，提高了教学效率。另一方面，针对重点实验环节和拓展实验环节进行线下实验。新引入的等温滴定微量热法表征酶活线下实验，既丰富了原实验内容，也加强了对学生创新思维的培养。线上打基础，线下做延伸的混合教学模式，兼顾了对学生知识与能力的培养，取得了较好的反馈。尤其在常态化疫情防控背景下，这种混合模式或可成为一种优化实验课程设计、提高教学效果的有效方式，也可为相关院校的实验教学安排提供参考。