重金属(如Pb²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺)的毒性、持久性、不可生物降解特性，对生态环境和人类健康产生了严重的负面影响^[1]。云南省拥有丰富的高原淡水湖泊资源，对高原湖泊水的保护和治理是可持续发展及维持生态平衡的关键环节^[2]。因此，把检测高原湖泊水样中的重金属离子纳入本科化学实验教学中有利于学生了解当前本省高原湖泊水重金属污染现状，培养学生社会责任感，提升绿色环保意识，正确引导学生形成人与自然和谐发展的观念。

荧光纳米材料具有较高的荧光强度和良好的光稳定性^[3]，将其应用于离子检测还具有灵敏度高、选择性好、操作简单、成本低、可视化效果好等特点^[4]。目前，研究较多的荧光纳米材料主要包括金属纳米簇、半导体量子点、碳点等。凌洁等^[5]制备了以半胱氨酸为稳定剂的金纳米簇作为检测水中Cu²⁺的荧光探针。Zhang等^[6]制备了金纳米簇作为检测Ag⁺和Hg²⁺的双功能荧光探针。Zhang等^[7]构建了一种基于量子点的比率荧光探针(G-QDs和R-QDs)对水样中的Cu²⁺进行检测。Xu等^[8]构建了Arg/Glu-CQDs荧光探针用于对水样中Fe³⁺的检测。Wang等^[9]合成了FA-CQDs用于检测水溶液中的Hg²⁺。研究得知，荧光纳米探针对水样中的重金属离子的检测可操作性强，实验结果可观。但多数研究的检测对象单一，无法实现对多种重金属离子进行高通量检测。故本实验采用纳米荧光探针检测水样中重金属离子的方法，结合阵列式传感技术，实现检测对象由单靶物到多靶物的转变。

目前大学本科实验教学存在教学内容陈旧、重复，实验仪器大型化且维修费用昂贵，检测对象单一，检测方法多用于常量分析等问题。为此本实验引入与课程理论知识联系密切的科研热点及前沿科学研究技术来解决实际问题，借助智能手机实现对水样中重金属离子的检测。

综合以上几个方面，设计了“RGB阵列式荧光传感技术用于检测高原湖泊中多种重金属离子”实验。实验以柠檬酸钠和聚丙烯酰胺为原料合成蓝色荧光CDs (对Pb²⁺具有选择性识别)，以巯基丙酸为稳定剂合成绿色荧光CdTe QDs (对Cu²⁺具有选择性识别)，以BSA为稳定剂合成红色荧光Au NCs (对Hg²⁺具有选择性识别)。考虑到实验结果的可视化及准确性，本实验设计了两种不同体积比混合的CDs/BSA-Au NCs比率型荧光纳米探针，用于对Pb²⁺、Hg²⁺的检测。在96孔板中，加入以上荧光探针形成5 × 12的阵列形式，并分别与不同种重金属离子发生荧光猝灭反应。因溶液的荧光颜色与RGB值有较好的线性关系。故使用智能手机APP——Colorimeter X在365 nm紫外灯照射下识别溶液的RGB。绘制RGB值与Pb²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺浓度的标准曲线。最后，将预处理后的某高原湖泊水样进行加标回收实验。

该实验为综合性实验，实验涵盖了材料化学、分析化学、环境科学等学科领域的课程理论知识、实验技能和方法，实现学科交叉融合。学生通过完成该实验可以学习RGB多色纳米荧光探针检测重金属离子的知识、技能和方法，深刻领悟分析化学方法所体现出的“4S + 3A”(简单(Simpleness)、快速(Speediness)、选择性(Selectivity)、灵敏度(Sensitivity)、准确度(Accuracy)、自动化(Automatization)、应用(Application))的本质特点，提升综合分析能力、动手操作能力、团队协作能力、创新能力，体会到该实验方法对环境治理具有指导意义以及感受到学科交叉的运用价值，激发学生对化学学习和科学研究的热情。

在365 nm紫外灯照射条件下，三种荧光探针Au NCs、CdTe QDs、CDs分别显示蓝色、绿色和红色，对应不同的R、G、B值。CDs、CdTe QDs、Au NCs可通过荧光猝灭的形式，分别对Pb²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺有选择性的响应。随着重金属离子浓度的增大，它们的荧光强度均呈现降低的趋势。荧光探针与重金属离子混合液的R、G、B值也会因荧光强度的改变而改变。据此，在365 nm紫外灯照射下，可以通过手机检测混合液R、G、B值的变化，如图 1A–C，分别建立重金属离子浓度与R值、G值、B值的线性关系，实现对Pb²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺的单色荧光检测。

CDs/Au NCs比率型荧光探针检测Pb²⁺、Hg²⁺原理分别是CDs对Pb²⁺有响应发生荧光猝灭，Au NCs对Pb²⁺无响应不会发生荧光猝灭，将CDs与Au NCs按相应体积比构建比率型荧光探针，将Au NCs作为参比探针，CDs作为响应探针。如图 1D所示，随着Pb²⁺浓度的增加，体系发生从蓝色到粉色的显著颜色变化。Au NCs对Hg²⁺有响应发生荧光猝灭，CDs对Hg²⁺无响应不会发生荧光猝灭，将CDs与Au NCs按相应体积比构建比率型荧光探针，将CDs作为参比探针，Au NCs作为响应探针。如图 1E所示，随着Hg²⁺浓度的增加，体系发生从粉色到蓝色的显著颜色变化。通过手机检测混合液在365 nm紫外灯照射下所得荧光的R、G、B值的变化，分别建立C(Pb²⁺)、C(Hg²⁺)与B/R值的线性关系实现对Pb²⁺、Hg²⁺的比率型荧光检测。

测试方法：如图 2所示，在ZF-7A便携式紫外灯(365 nm)下，用智能手机检测对应的装有荧光探针溶液96孔板孔道，记录RGB值。

本次实验所需主要试剂或材料见表 1。

本次实验所需主要仪器见表 2。

表征方法：利用透射电子显微镜(TEM)表征所合成CDs、CdTe QDs、Au NCs的形貌。

(1) 蓝色碳点(BCDs)的合成。

参考合成CDs的相关文献^[9]，并进行简单修改。依次向50 mL烧杯中加入1.0 g柠檬酸钠、20 mL蒸馏水，磁力搅拌使固体完全溶解，再加入0.52 g聚丙烯酰胺，磁力搅拌溶解得透明胶状溶液。将混合物转移至50 mL聚四氟乙烯内衬的反应釜中，加热至200 ℃ 3 h。反应结束后，待反应釜冷却至室温，将含有CDs的溶液透析(1000 Da) 3 h进行纯化。将纯化后的CDs置于4 ℃冰箱待用。制备流程见图 3。

(2) 红色金纳米簇(Au NCs)的合成。

参考文献^[10]的做法，并略作改进。称取0.5 g牛血清蛋白，溶于10 mL蒸馏水中，磁力搅拌溶解，将溶液转移至100 mL圆底烧瓶。接着加入10 mL四氯金酸溶液(10 mmol·L⁻¹)。在37 ℃下磁力搅拌2 min，逐滴加入1 mL氢氧化钠溶液(1 mol·L⁻¹)，随后加热至100 ℃，磁力搅拌下反应7 min，得到Au NCs。透析纯化3 h，将纯化后的金纳米簇保存在4 ℃冰箱待用。制备流程见图 4。

(3) 绿色碲化镉量子点(CdTe QDs) 的合成。

参照文献^[11–13]的方法，并进行一定的改进。依次向100 mL烧杯中加入0.05 g氯化镉半(五水合物)、50 mL蒸馏水，搅拌使固体完全溶解。再加入20 μL巯基丙酸，剧烈搅拌，并用1 mol·L⁻¹的氢氧化钠溶液调节pH至10.5–11.0，将混合液转移至250 mL三颈烧瓶。将0.01 g亚碲酸钾溶于50 mL蒸馏水中，搅拌使固体完全溶解，将溶液转移至上述混合液中。接着加入1 mL 85 mg·mL⁻¹硼氢化钠溶液并搅拌5 min，在100 ℃搅拌回流20 min，得到绿色碲化镉量子点。最后，将碲化镉量子点与无水乙醇以体积比1 : 2混合、离心(转速为10000 r·min⁻¹，离心10 min)，取下层沉淀物分散在蒸馏水中，避光保存在4 ℃冰箱待用。制备流程见图 5。

实验室所提供的重金属离子溶液浓度分别为：100 mmol·L⁻¹ Pb(NO₃)₂溶液、100 mmol·L⁻¹ Cu(SO₄)₂溶液、10 mmol·L⁻¹ HgCl₂溶液。

按照梯度稀释，分别配制0.8、8、20、40、80、500、800、1000、2000、4000、8000 μmol·L⁻¹ Pb(NO₃)₂溶液；配制0.8、8、40、80、100、200、400、600、800、1000、2000 μmol·L⁻¹ Cu(SO₄)₂溶液；配制8、80、300、350、400、450、500、550、600、800、1000 μmol·L⁻¹ HgCl₂溶液，保存待用。

依次向黑色96细胞培养板中加入70 μL蒸馏水、70 μL PBS (pH = 7.4)、175 μL荧光探针溶液、35 μL不同浓度的金属离子溶液。将混合液混匀，避光反应15 min。在365 nm紫外灯照射下，用智能手机APP (Android系统可用“相机颜色识别器”软件，iOS系统可使用“Colormeter X”软件)对荧光探针溶液的RGB值进行识别和记录。将RGB值与金属离子浓度之间进行线性拟合，得到标准曲线。手机检测流程见图 6。

取100 mL高原湖泊水样于250 mL烧杯中，滴加1滴浓硝酸，在磁力搅拌器上加热浓缩至约2 mL溶液时，冷却至室温，用比色管定容至10 mL，过滤，滤液摇匀，pH调至中性，待测。实际水样前处理流程见图 7。对水样进行加标回收实验，根据实验结果计算加标回收率。

如图 8所示为所制备CDs、CdTe QDs、Au NCs的透射电镜照片，呈现出了纳米尺寸的形貌特征。课前通过向学生展示纳米材料的微观形貌图片，可以从微观层次加深学生对纳米材料的了解。

如图 9A所示，在CDs溶液中，分别加入不同浓度的Pb²⁺溶液，避光反应10 min后，用荧光分光光度计，在激发波长为350 nm、起始波长为380 nm、终止波长为550 nm、电压为450 V的条件下进行扫描，记录其荧光强度和最大发射波长；如图 9B所示，将Cu²⁺加入CdTe QDs溶液中，用荧光分光光度计，在激发波长为365 nm、起始波长为450 nm、终止波长为600 nm、电压为550 V的条件下进行扫描，记录其荧光强度和最大发射波长；如图 9C所示，将Hg²⁺加入Au NCs溶液中，用荧光分光光度计，在激发波长为365 nm、起始波长为550 nm、终止波长为720 nm、电压为700 V的条件下进行扫描，记录其荧光强度和最大发射波长。

根据荧光光谱可知，随着重金属离子溶液Pb²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺浓度的增加，三种纳米材料的荧光强度逐渐降低，荧光逐渐猝灭。为此，该方式是实现后续智能手机检测的依据。

如图 10所示，黑色96孔板第A–C行中，分别加入CDs、CdTe QDs、Au NCs单发射荧光探针溶液，在第D、E行分别加入V(CDs) : V(Au NCs) = 2 : 1、V(CDs) : V(Au NCs) = 1 : 1的双发射比率型荧光探针溶液，加入对应浓度的重金属离子溶液后，荧光探针的颜色发生改变。在365 nm紫外灯照射下，通过手机APP检测混合液RGB值的变化，分别建立C(Pb²⁺)、C(Cu²⁺)、C(Hg²⁺)与R/G/B值的线性关系，以及C(Pb²⁺)、C(Hg²⁺)与B/R值的线性关系，实现对重金属离子的定量分析检测。

如图 11A所示，随着Pb²⁺浓度增加，CDs溶液的B值减小，Pb²⁺浓度在2.0–1000 μmol·L⁻¹范围内呈现良好线性关系，相关系数R² = 0.9966，检出限为7.8 μmol·L⁻¹，略高于地表水环境质量标准^[14]要求；如图 11B所示，随着Cu²⁺浓度增加，CdTe QDs溶液的G值减小，Cu²⁺浓度在10–100 μmol·L⁻¹范围内呈良好线性关系，相关系数R² = 0.9902，检出限为3.1 μmol·L⁻¹，符合地表水环境质量标准^[14]规定。可见，本方法可用于水体中的Cu²⁺含量的测定；如图 11C所示，随着Hg²⁺浓度增加，Au NCs溶液的R值减小，Hg²⁺浓度在30–80 μmol·L⁻¹范围内呈良好线性关系，相关系数R² = 0.9655，检出限为21.3 μmol·L⁻¹，高于地表水环境质量标准^[13]要求。为了提高分析的灵敏度和降低方法的检出限，利用单色信号检测Hg²⁺、Pb²⁺还不能满足当前环境水样的分析需求，为此，继续开发比率型的荧光检测技术实现Hg²⁺、Pb²⁺的检测。

如图 11D、11E所示，在96孔板第4–5排比率荧光通道分别检测Pb²⁺、Hg²⁺时，随着金属离子浓度的增加，B/R值分别呈现出降低和升高的趋势，这主要的原因是，检测过程中，Pb²⁺和Hg²⁺分别选择性地作用于CDs和Au NCs。用B/R值对C(Pb²⁺)作图，得线性回归方程，线性范围2.0–800 μmol·L⁻¹，相关系数R² = 0.9942，检出限为0.02 μmol·L⁻¹，低于地表水环境质量标准0.1 mg·L⁻¹ (即0.48 μmol·L⁻¹) ^[14]；用B/R对C(Pb²⁺)作图，得线性回归方程，线性范围0.8‒45 μmol·L⁻¹，相关系数R² = 0.9967，检出限为0.004 μmol·L⁻¹，低于地表水环境质量标准^[14] 0.001 mg·L⁻¹ (即0.00499 μmol·L⁻¹)，说明本方法具有较高的灵敏度和较低的检出限，则可实现对环境水样中Pb²⁺、Hg²⁺的检测。

实验发现：单色型的检出限高、灵敏度低，比率型的检出限低、灵敏度高，原因是：比率型的荧光检测可减小检测环境的干扰；并且，比率型的检测模式具有良好的内参比校正关系。为此，在后续实际应用过程中，本方法选用绿色荧光CdTe QDs来检测Cu²⁺，利用比率型的探针检测Pb²⁺和Hg²⁺。

本实验中检出限是平行做7个空白样品，将空白信号标准偏差(3σ，n = 7)的3倍代入线性方程进行计算，根据IUPAC的标准，σ代表空白实验组的标准偏差。如表 3所示，本研究涉及到单色型和比率型对金属离子的检测，对比了单色型和比率型检测同种金属离子时的检出限，比率型表现出更低的检出限，灵敏度更高。比率型检测方式最低检出限均低于地表水环境质量标准。

本实验选用高原湖泊水样(以某高原湖泊水样为例)，采用回收加标的方法实现对水样中重金属离子Cu²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺的测定，如表 4所示，得到Cu²⁺的回收率在92.0%–106.1%之间，得到Pb²⁺的回收率在96.6%–106.3%之间，Hg²⁺的回收率在105.8%–108.5%之间。回收率均在90%–110%之间，表明该实验方法在实际样的应用方面可行。

本实验合成不同荧光发射的三种纳米材料来实现对Pb²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺的检测。在黑色96孔板中，基于手机APP——Colorimeter X读取溶液的RGB值，构建阵列式的高通量检测重金属离子的方法，并应用于测定高原湖泊水样的重金属离子。

本实验设计具有一定的创新性和前沿性，引入基础和应用研究的新进展，有利于拓宽学生知识面，进一步感受到前沿技术给教学科研带来的变革。同时本实验切合化学实验教学实际，涉及分析化学、材料化学、环境科学等多个化学二级学科，在实验中培养学生的多学科交叉观念与视角。在应用于高校本科综合实验的开展方面，可解决部分高校实验仪器短缺、本科实验枯燥、与科研前沿相脱轨的问题。

(1) 选用纳米材料，践行“科教融合”，让本科生体会走进纳米微世界的乐趣。

(2) 基于96孔板RGB阵列式的高通量检测方法，体现分析化学方法的“4S + 3A”特性。

(3) 多学科交叉、操作便捷、手机检测、可视化分析，体现“两度一性”。