“点击化学”(Click chemistry)是2022年诺贝尔奖得主Sharpless K. B.在2001年提出的有机合成新概念^[1]，即利用可靠的化学转化方法将化学单元相连接，高收率、高选择性地得到目标化合物的模块化合成手段。亚铜催化的末端炔烃与叠氮发生[3+2]环加成反应生成三氮唑(CuAAC反应)，则是应用最广泛的点击化学反应，如图 1所示。

点击化学目前已经成为了合成化学^{[2, 3]}、材料科学^{[4, 5]}和生命科学^[6–9]重要的化学工具。例如2017年，Brown T.和Tavassoli A.小组利用CuAAC反应实现了DNA的交联^[10]。而2019年，Flood A. H.小组用简单的两组分CuAAC反应，构建了三氮唑分子笼，因氢键作用，能选择性识别氯离子，被美国《化学工程新闻》(C & EN)评选为2019年世界年度分子^[11]。

简洁高效的特性使得CuAAC反应非常适合本科教学，然而在本科教学实践中却较少涉及。2005年，美国Sharpless W. D.小组将CuAAC反应引入了本科教学，利用叠氮化钠制备烷基叠氮，与炔烃反应合成三氮唑^[12]。2021年国内高等教育出版社的《基础化学实验——有机与高分子实验分册》也将CuAAC点击化学反应写入，该实验中使用对甲苯磺酰基叠氮^[13]。无论叠氮化钠还是对甲苯磺酰基叠氮，除了潜在爆炸风险外，还都是剧毒化合物(安全标识T⁺)，严重阻碍了其在本科教学中的推广。因此，改进实验试剂，避免操作或使用叠氮类化合物，提高实验安全性，是在本科教学中推广CuAAC反应面临的挑战和难题。

为了提高实验的安全性，并增加实验的趣味性，我们对此实验进行了改进。利用乙酰丙酮(1)与安全的一水5-氨基-1H-四氮唑(2)生成5, 7-二甲基四氮唑[1, 5-a]嘧啶(3a)，替代有毒易爆的叠氮类化合物^{[14, 15]}。化合物3a在溶液中互变异构生成化合物2-叠氮基-4, 6-二甲基嘧啶(3b)，可以与4-乙炔基苯甲醚(4)反应，最终生成三氮唑化合物(5)，避免了操作叠氮化合物，如图 2所示。

锌是人体内丰度第二的过渡金属元素，仅次于铁，在基因表达、细胞凋亡、酶活性调控、神经传导等生命过程中有重要功能。开发锌离子的跟踪与检测技术，特别是高灵敏度和高选择性的锌离子荧光探针具有重要的应用价值^{[16, 17]}。2016年Woodruff T. K.与O’Halloran T. V.就利用锌离子探针和多种成像技术，呈现了受精卵形成过程中的“锌烟花”现象(Zinc sparks) ^[18]。实验合成的化合物5由于螯合荧光增强效应，能作为锌离子探针，具有较高选择性与灵敏度。

综上，我们对CuAAC点击化学反应进行了改进，通过以四氮唑替代叠氮化合物，避免了中毒与爆炸风险，提高了实验的安全性。利用合成的化合物5对锌离子的荧光响应，通过锌离子识别过程中色彩的变化，提高了实验的趣味性。

CuAAC反应机理如图 3所示，一分子亚铜催化剂与末端炔烃的π键配位，增强sp碳氢的酸性，进而与另一分子亚铜催化剂形成碳铜键，消除质子，得到双铜活化的炔烃。进而与叠氮1, 3-偶极子发生环加成反应并离去一分子亚铜，得到具有碳铜键的三氮唑。最终碳铜键质子解，形成三氮唑产物^[19]。

三氮唑化合物5识别锌离子的机理如图 4所示。化合物5中三氮唑环和嘧啶环之间以碳氮单键相连，在溶液中单键旋转会带来分子构象的改变；加入锌离子后，由于锌离子螯合配位，增大了分子的刚性平面并改变了分子中电荷的分布，使得荧光增强，即“螯合荧光增强”效应(CHEF) ^[20]。

实验中所需要用的试剂如表 1所示，其中^*表示必需试剂，实验中所用到的溶剂如乙醇、乙酸乙酯、甲苯、二氯甲烷等，均购自国药试剂，饱和氯化铵溶液为实验室自配，不在表 1中。

实验中所用仪器如表 2所示，常用玻璃仪器不在列表中。

如图 5，在5 mL圆底烧瓶中加入磁子，将氯化铜(27 mg，0.2 mmol)溶解在乙醇(3 mL)形成绿色溶液。将抗坏血酸钠(Sodium ascorbate，35 mg，0.2 mmol)加入到该绿色溶液中，室温搅拌5 min至生成无色亚铜溶液。移液枪量取乙酰丙酮(化合物1，102 μL，1.0 mmol)并称取一水5-氨基-1H-四氮唑(化合物2，103 mg，1.0 mmol)，均加入到无色溶液中，室温下反应1.5 h，得到白色悬浊液。将反应液与饱和氯化铵水溶液(10 mL)混合并用乙酸乙酯萃取(4 × 20 mL)，将有机相合并，无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪除去溶剂(乙酸乙酯可回收再使用)，得到白色固体化合物3 (134 mg)，产率为90%。

如图 6，在5 mL圆底烧瓶中，依次加入磁子、化合物3 (75 mg，0.5 mmol)、催化剂噻吩-2-甲酸亚铜(2 mg，0.01 mmol)、4-乙炔基苯甲醚(化合物4，80 mg，0.6 mmol)和溶剂甲苯(2 mL)。回流20 min，得到棕红色悬浊液。用塞有棉花并装入硅胶(约0.2 g)的滴管过滤反应液并用甲苯(1 mL)洗涤硅胶层(洗耳球加压)。向浅黄色滤液中加入石油醚(10 mL)并搅拌(打浆法)，得到浅黄色悬浊液。用塞有棉花的滴管过滤，干燥后得到浅黄色固体(115 mg)，产率82%。(注：4-乙炔基苯甲醚易熔化，宜用差减法称量并溶解加入。)

测定化合物3和5的熔点和固体红外光谱。并称取适量样品溶解于氘代溶剂，送样测试¹H NMR和¹³C{¹H} NMR谱。

快速称取化合物5 (约1.4 mg)溶解在乙酸乙酯(25 mL)中备用(2 × 10⁻⁴ mol∙L⁻¹)，取10支3 mL玻璃样品管，编号为1–11号，分别加入四水合醋酸锰(1，Mn²⁺)、四水合氯化亚铁(2，Fe²⁺)、三氯化铁(3，Fe³⁺)、氯化钴(4，Co²⁺)、氯化镍(5，Ni²⁺)、氯化亚铜(6，Cu⁺)、氯化铜(7，Cu²⁺)、氯化锌(8，Zn²⁺)、氯化钠(10，Na⁺)、氯化钙(11，Ca²⁺)各约1 mg，其中9号不添加金属盐。向11支样品管中各加入1.5 mL所配化合物5溶液，盖上瓶盖。将样品超声或振荡促进分散溶解。将所有样品瓶盖打开，在暗箱式紫外分析仪中按1–11顺序排成一列，分别在室内光线下和365 nm紫外光灯下，观察样品的颜色变化。(除锌盐以外，其他参比金属盐可选)。

精确称量化合物5 (7.0 mg，0.025 mmol)，用25 mL容量瓶配制成溶液(1 × 10⁻³ mol∙L⁻¹)，用移液管移取1.0 mL溶液，并用100 mL容量瓶稀释定容成待测溶液(1 × 10⁻⁵ mol∙L⁻¹，10 μmol∙L⁻¹)。精确称取无水氯化锌(6.8 mg，0.050 mmol)，溶于1 mL乙腈中，用二氯甲烷稀释定容到50 mL (1 × 10⁻³ mol∙L⁻¹，1000 μmol∙L⁻¹)。取3 mL化合物5的溶液(1 × 10⁻⁵ mol∙L⁻¹，10 μmol∙L⁻¹)，加入到石英比色皿中，用岛津RF-5301荧光光谱仪在365 nm入射光、入射狭缝宽度5 nm、出射狭缝宽度3 nm下，测定样品无锌离子时的荧光，然后每次加入6 μL的氯化锌溶液(1 × 10⁻³ mol∙L⁻¹，1000 μmol∙L⁻¹)，测定样品的荧光。加5次后，则溶液中化合物5和Zn²⁺浓度均达到10 μmol∙L⁻¹。所测得的6次荧光发射光谱，代表了在化合物5浓度为10 μmol∙L⁻¹时，Zn²⁺浓度分别为0、2、4、6、8、10 μmol∙L⁻¹时的荧光光谱。

化合物3红外光谱：3425，3073，1638，1621，1530，1447，1432，1377，1347，1323，1244，1122，1034，994，888，817，781，649，636 cm⁻¹。

化合物5红外光谱：3163，3082，2961，2928，2838，1595，1537，1498，1438，1417，1341，1236，1186，1174，1023，860，839，780，776，656，613，574 cm⁻¹。

化合物3熔程：146.0–146.7 ℃。

化合物5熔程：140.7–141.0 ℃。

红外光谱中，叠氮化合物通常在2160–2120 cm⁻¹有强吸收峰，而在我们合成的化合物3的红外谱图中，未观测到在2160–2120 cm⁻¹有明显吸收，如图 7所示。说明在固体状态下，化合物3主要以四氮唑3a形式存在。

化合物3核磁共振表征数据：¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)：δ 7.37 (s, 1H)，2.86 (s, 3H)，2.67 (s, 3H) [only 3a]；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)：δ [3a] 6.99 (s, 1H)，2.97 (s, 3H)，2.77 (s, 3H)；[3b] 6.78 (s, 1H)，2.44 (s, 6H)，Integral ratio 3a : 3b = 4 : 1；¹³C{¹H} NMR (101 MHz, CDCl₃)：δ 169.3，169.1，155.1，144.7，116.2，112.8，25.9，23.9，17.0 [3a+3b]。

化合物5核磁共振表征数据：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.73 (s, 1H)，7.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H)，7.08 (s, 1H)，6.98 (d, J = 8.7 Hz, 2H)，3.85 (s, 3H)，2.61 (s, 6H)；¹³C{¹H} NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 169.7，159.9，154.2，147.8，127.5，122.9，119.7，117.7，114.3，55.5，24.1。

核磁数据显示，化合物3在氘代二甲亚砜中，仅有四氮唑形式3a的信号峰，完全不存在叠氮形式的3b。这与固体红外数据共同证实化合物3在固体状态下，以四氮唑形式3a存在。说明在实验中避免了操作叠氮化合物带来的安全风险。

氘代氯仿中的核磁共振氢谱，则显示出3a和3b两组信号峰，积分面积比例约为4 : 1。说明在氘代氯仿溶液状态下，化合物3a和3b存在互变异构。这解释了实验中固体状态下四氮唑形式的化合物3，能在甲苯溶液中和炔烃4发生点击化学反应生成三氮唑化合物5。说明在甲苯溶液中，3a与3b存在互变异构平衡，随着反应的进行，平衡朝着3b移动，最终与炔烃4完全生成目标化合物5。

定性测定化合物5对锌离子的识别选择性实验结果如图 8所示。在365 nm紫外光灯照射下，没有加入金属盐的9号样品呈现出很微弱的荧光，分别加入Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu⁺、Na⁺和Ca²⁺，荧光均未出现明显变化。含Fe³⁺和Cu²⁺的样品相对于样品9表现出荧光减弱，是由于d⁵电子结构的Fe³⁺和d⁹电子结构的Cu²⁺具有顺磁性，促进了系间窜越，导致荧光淬灭。加入Zn²⁺的8号样品，呈现天蓝色荧光，对比9号样品，荧光强度明显增强，波长红移。从这一组定性荧光实验可以看出，我们合成的化合物5，可以实现Zn²⁺裸眼荧光识别，对于Zn²⁺有良好选择性。

锌离子对化合物5的二氯甲烷溶液的荧光滴定实验结果如图 9所示，可见纯的化合物5在浓度为10 μmol∙L⁻¹的二氯甲烷溶液中、365 nm入射光下，有微弱的荧光信号，荧光最大发射峰在411 nm位置。在加入氯化锌溶液后，锌离子的浓度分别为2、4、6、8和10 μmol∙L⁻¹时，荧光最大发射峰相比于锌离子浓度为0时，出现了明显的红移，出现在462 nm的位置。可以看出，随着锌离子浓度的增加，荧光强度逐渐增强，荧光强度对锌离子的浓度响应灵敏。

荧光滴定实验中，以365 nm入射光下462 nm处荧光发射强度为纵坐标，以锌离子浓度为横坐标进行线性回归拟合。如图 10所示，在测试条件和所测浓度范围内，荧光的强度与溶液中锌离子的浓度成正比。荧光强度y与锌离子浓度x (单位μmol∙L⁻¹)公式为：

$ y = 51.80x − 21.08\text{，}R^{2} = 0.9815 $

此结果初步证实，锌离子荧光探针5有可能用于锌离子的定量检测。

在教学组织上，根据实际教学需要，本实验设计了两种实验学时组织形式，对时间进行了合理的安排(考虑学生进度差异，留足了余量)，如表 3所示。对于拥有熟练有机化学实验基础的学生采用8学时小型综合实验，可以全面培养学生能力。对学时数有限制、学生实验操作熟练度不高的课堂，可采用4学时基础实验，耗时较长的化合物3合成步骤可以由实验教师提前用化合物1和2依文献在150 ℃下无溶剂缩合反应2–5 min，快速大量制备^[21] (20 mmol原料，得产物2.4 g，产率80%，可供32人次实验使用)，同时省略荧光滴定实验，此实验安排同样兼具了科学性和趣味性。

本文报道了一个改进的CuAAC点击化学反应，使用廉价易得的原料乙酰丙酮、一水5-氨基-1H-四氮唑与4-乙炔基苯甲醚高效地合成了一种新型锌离子荧光探针——三氮唑化合物5。兼具安全性和趣味性，有助于在实验教学中培养学生创新能力和推广在科研中具有重要意义的CuAAC点击化学反应。本实验将有机化学、配位化学、分析化学、化学信息学(文献检索)和波谱学有机地结合在一起。在理论上，既加深了学生对炔烃、叠氮、偶极子、环加成、互变异构等有机理论课程中基础知识的掌握，又拓宽了学生对点击化学、荧光探针、配位荧光增强、荧光淬灭和物质在不同相态下的不同形态等有关科研领域的视野。在实践上，既提高了学生加热、萃取、过滤、干燥、打浆和溶剂脱除的基本操作技能，又提高了学生用有机波谱学等测试手段解决实验中异常现象的探索能力和利用快速定性与精确定量手段研究实验现象背后科学原理的创新能力。

(1) 改进出了一种高安全性的CuAAC教学实验。

(2) 发现了点击化学产物5的Zn²⁺荧光探针性质。

(3) 通过对Zn²⁺的裸眼荧光识别，增强了趣味性。