香豆素类衍生物因其结构稳定、修饰位点多、荧光量子产率高等优点被广泛应用于荧光探针领域^{[1, 2]}，而香豆素-3-羧酸(图 1)是合成香豆素衍生物的重要中间体，其合成方法具有重要的研究意义。目前面向本科生的有机化学实验教材中，实验“香豆素-3-羧酸的制备”利用Knoevenagel缩合反应这一经典反应^[3]：以水杨醛和丙二酸二乙酯为反应物，无水乙醇为溶剂，在六氢吡啶/冰醋酸的双重催化作用下，加热至80 ℃反应2 h，得到中间体香豆素-3-羧酸乙酯，酯分离纯化后再经水解、酸化得到最终目标物香豆素-3-羧酸(图 2，方程式a) ^[4–7]。六氢吡啶为第二类易制毒试剂，易燃且具有强刺激性，存在一定的安全隐患，排放的废液具有环境污染性，不利于学生实验的开展。随着“绿色化学”理念的提出和环境保护意识的加强，亟需对该实验方法进行改进。

近年来微波、超声波、新型多相催化剂、离子液体、无溶剂等技术在有机合成中的应用，香豆素-3-羧酸的合成方法逐渐多样化。2010年邹碧群等在超声波辅助下合成香豆素-3-羧酸酯，催化剂仍然为六氢吡啶(图 2，方程式b) ^[8]。2016年杨文生以二乙胺为催化剂，乙醇为溶剂两步合成香豆素-3-羧酸，总产率不到80% (图 2，方程式c) ^[9]。2017年Shafto等报道了不同氨基酸催化下的Knoevenagel反应(图 2，方程式d) ^[10]。2019年Sharma等在Green Chemistry期刊上发表了六氢吡啶催化下，无溶剂合成3-乙酰基-香豆素-2酮的反应(图 2，方程式e) ^[11]。

在参考文献基础上，经过实验室多次摸索，选用更为绿色环保的L-脯氨酸作为催化剂，在无溶剂条件下，采用“一锅煮”的方式制得香豆素-3-羧酸(图 3)，并用多种手段对结构进行表征，同时增加了紫外吸收光谱和荧光光谱性质研究。

该反应的反应机理如图 4所示，在L-脯氨酸的双重催化下，得到烯醇式中间体，接着在L-脯氨酸作用下亲核进攻水杨醛，酚羟基进攻酯基碳，生成氧鎓离子中间体；其次，经过环内氢离子转移，进行β-消除得到香豆素-3-羧酸乙酯；然后酯在碱性条件下水解开环，最后酸性条件下重新酸化得到最终产物。

当有机分子的外层电子吸收紫外或可见光辐射时，就会从基态向激发态跃迁，从而产生明显的特征吸收峰，即紫外-可见吸收光谱。这种跃迁主要有四种方式，按照所需能量大小顺序为：σ → σ^* > n → σ^* > π → π^* > n → π^*。当有机分子中含有π键时，π电子易发生跃迁，其中共轭π键的吸收波长通常处于近紫外区，属于强吸收；当有机分子中含有由杂原子组成的π键基团时，既有π电子又有n电子，n电子易与所形成π键的π^*轨道发生n → π^*跃迁，吸收波长通常在近紫外区甚至可见光区，谱带强度弱。香豆素-3-羧酸分子的紫外吸收光谱中，最常见的吸收峰就是由这两种跃迁所产生，而跃迁产生的吸收峰的位置和强度又受到溶剂极性和溶液pH的影响；此外，当与金属离子产生配位作用时，其吸收峰的位置和强度也会发生变化。

一些物质经一定波长的光照射后，激发态的分子或原子会返回到基态，同时发射出不同强度的光，即为荧光。通常具有刚性平面结构和大共轭体系的化合物能够发射荧光，这样的物质被称为荧光化合物。荧光化合物的发光本质是电子的激发跃迁和回跳到基态的过程中能量变化的反映。当固定激发波长不变，发射光波长与荧光强度的关系谱图即为荧光发射光谱。当一定波长的激发光照射到化合物上，分子的电子因吸收能量而从较低的能级跃迁到较高的振动能级，两个能级的能量差等于所吸收光子的能量。激发分子与溶剂分子的相互作用及能量转移、外转化会产生荧光强度减弱甚至消失。激发分子与引入的金属离子有不同的配位作用，对其荧光强度产生影响。

主要仪器：Nicolet iS10型傅立叶变换红外光谱仪(美国ThermoFisher公司), Ultrashield Plus 600 MHz型核磁共振波谱仪(美国布鲁克光谱仪器公司)，Cary 60型紫外-可见分光光度计(美国Agilent公司)，Hitachi F-4600型荧光分光光度计(上海德沃斯科技仪器有限公司)，EL104100型分析天平(美国梅特勒公司)，SGW X-4A型熔点仪(上海仪电物理光学仪器有限公司)，LAB-500型金属浴(西安华太科思有限公司)，HMS-203D型磁力加热搅拌器(上海沪析实业有限公司)。

主要试剂：丙二酸二乙酯、水杨醛、L-脯氨酸、氨基磺酸(上海国药基团)；碳酸钾、4-二甲氨基吡啶(上海阿拉丁生化科技公司)，L-赖氨酸(天津市福晨化学试剂公司)，DL-色氨酸(中国惠兴生化试剂)，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(上海成捷化学有限公司)；所用试剂均为分析纯。

如图 5所示搭建反应装置：称取0.115 g (1%，物质的量分数，下同) L-脯氨酸于25 mL三口烧瓶中，依次加入1.0 mL (0.01 mol)水杨醛、1.7 mL (0.011 mol)丙二酸二乙酯，无溶剂条件下100 ℃恒温反应，反应每10 min用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程(展开剂：V_石油醚 : V_乙酸乙酯 = 4 : 1，下同)。约60 min后反应趋于完全，中间体香豆素-3-羧酸乙酯反应完成。

待反应体系稍冷，向体系中依次加入10 mL 20%的氢氧化钠溶液、10 mL乙醇，继续加热回流，用TLC跟踪反应进程，约15 min水解反应结束。

将反应体系转移到100 mL烧杯中，磁力搅拌下滴加6 mol∙L⁻¹盐酸溶液，直至沉淀完全，测溶液pH为1–2。冷却后减压过滤，粗产品用水重结晶，得到1.76 g香豆素-3-羧酸，分离产率为92%。

(1) 熔点测定：将装好香豆素-3-羧酸的熔点管放入熔点仪插槽中开始电加热，记录样品开始出现液滴时的温度，记为初熔温度，到晶体完全消失时记为终点温度，该温度区间即为香豆素-3-羧酸的熔点。

(2) 红外光谱：将1 mg左右香豆素-3-羧酸固体粉末与100 mg左右干燥的光谱纯溴化钾粉末一起研磨至粒度约2.0 μm后，装入模具，用压片机压成约1 mm厚的透明薄片测定红外光谱。

(3) 核磁共振氢谱：取8 mg香豆素-3-羧酸于核磁管中，加入500 μL氘代氯仿，震荡摇匀，放入600 MHz核磁仪中测定核磁共振氢谱。

(1) 香豆素-3-羧酸在不同极性溶剂中的紫外光谱。

分别以二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、二甲基亚砜、水为溶剂，配制浓度为1.0 × 10⁻⁴ mol∙L⁻¹的香豆素-3-羧酸溶液，测定不同溶剂下的紫外-可见吸收光谱。

(2) 香豆素-3-羧酸在不同pH溶液中的紫外光谱。

以N, N-二甲基甲酰胺为溶剂，配制1.0 × 10⁻² mol∙L⁻¹的香豆素-3-羧酸溶液。以Na₂HPO₄和NaH₂PO₄，Na₂HPO₄和NaOH，NaH₂PO₄和H₃PO₄，NaAc和HAc为缓冲液，制得浓度为1.0 × 10⁻⁴ mol∙L⁻¹、pH为1–13的香豆素-3-羧酸溶液，测定不同pH下的紫外-可见吸收光谱。

(3) 香豆素-3-羧酸与不同金属离子作用的紫外光谱。

用95%的乙醇配制1.0 × 10⁻³ mol∙L⁻¹香豆素-3-羧酸溶液。把Cr³⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺及Zn²⁺分别配制成浓度为1.0 × 10⁻³ mol∙L⁻¹的乙醇溶液。分别移取1.00 mL 1.0 × 10⁻³ mol∙L⁻¹的香豆素-3-羧酸溶液和金属离子溶液，乙醇定容至10 mL，测定紫外吸收光谱。

(4) 香豆素-3-羧酸与不同金属离子作用的荧光光谱。

用95%的乙醇配制1.0 × 10⁻³ mol∙L⁻¹香豆素-3-羧酸溶液。分别配制浓度为1.0 × 10⁻³ mol∙L⁻¹的Cr³⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺及Zn²⁺的乙醇溶液。分别移取1.00 mL 1.0 × 10⁻³ mol∙L⁻¹的香豆素-3-羧酸溶液和金属离子溶液，乙醇定容至10 mL，测定荧光光谱。

以反应物1.0 mL (0.01 mol)水杨醛、1.7 mL (0.011 mol)丙二酸二乙酯不变的条件下，进行反应条件筛选。

表 1实验数据显示，在仅改变反应催化剂种类情况下，氯化胆碱、氨基磺酸、L-赖氨酸、DL-色氨酸以及甘氨酸为催化剂时，乙醇回流120 min后，薄层板上仅检测到微量产物，未分离出产物；当催化剂选用二乙胺(加两滴冰醋酸)情况下，得到26%产率的香豆素-3-羧酸乙酯；碳酸钾为催化剂时，产率提高到32%；当将催化剂更换为L-脯氨酸时，反应时间缩短为90 min，产率提升为85%。可以看出，L-脯氨酸为催化剂时反应产率最高。同时考虑到该催化剂绿色环保，价格低廉，故确定本反应的催化剂为L-脯氨酸。

以L-脯氨酸为催化剂，考察不同溶剂、无溶剂及温度对产率的影响。

如表 2所示，乙醇为溶剂、80 ℃下，得到产率为85%的产物。当改为超声波辅助技术加热后，产率不升反降。在离子液体(1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐)为溶剂的情况下100 ℃反应90 min，薄层板上仅检测到微量产物，未分离出产物；当溶剂为二甲基亚砜时，温度100 ℃反应90 min，产率提高至89%。

受文献启发^[11]，结合反应物均为液体的特点，反应在无溶剂条件下，80 ℃至100 ℃时，随着反应温度的升高，反应时间缩短、产率升高。其原因可能是在缩合反应脱醇时，需要较高的温度。但当温度超过100 ℃，部分水杨醛被氧化，导致反应产率又下降。综合考虑，确定反应在无溶剂100 ℃条件下进行，反应时间60 min。

如表 3所示，以L-脯氨酸为催化剂，无溶剂100 ℃条件下，改变催化剂的用量，考察催化剂用量对产率的影响。发现当催化剂的用量为5%时，产率为82%，增加催化剂用量为15 mol%，在相同的反应时间内产率基本不再变化。

经过对反应催化剂、溶剂和温度的筛选，最终确定了最佳反应条件为：0.1 mol水杨醛和0.11 mol丙二酸二乙酯，以10% L-脯氨酸为催化剂，在无溶剂条件下，100 ℃反应60 min，香豆素-3-羧酸乙酯的产率可达95%。

根据上面香豆素-3-羧酸乙酯的最佳反应条件，对比分步合成与“一锅煮”方式对香豆素-3-羧酸产率的影响(表 4)。

由表 4所示，“一锅煮”与传统分步法相比，避免了中间体化合物的分离、纯化处理，最终产率提升为92%。可见，“一锅煮”法既节省时间、降低溶剂损耗，又具有后处理简单、反应收率高的优点。

综上，最终确定香豆素-3-羧酸的最佳反应条件为：0.1 mol水杨醛和0.11 mol丙二酸二乙酯，以催化剂用量为10% L-脯氨酸为催化剂，在无溶剂条件下，反应温度为100 ℃，反应时间60 min，得到的中间体不经分离，直接向体系中加入10 mL 20%的氢氧化钠溶液水解，再用6 mol∙L⁻¹盐酸溶液酸化得到产物香豆素-3-羧酸。

熔点仪检测产物熔点为192.0–194.0 ℃，与文献值191.0–193.0 ℃基本吻合。

FTIR谱图解析：如图 6所示，3444 cm⁻¹处的吸收峰为羧基中的O—H是伸缩振动吸收峰；3057 cm⁻¹处的吸收峰为芳环上C—H的伸缩振动吸收峰；1746 cm⁻¹处的吸收峰为环上内酯C＝O伸缩振动吸收峰；1684 cm⁻¹处吸收峰为羧基中C＝O伸缩振动吸收峰；1610，1567，1421 cm⁻¹处的吸收峰为苯环的骨架振动吸收峰；1208 cm⁻¹处的吸收峰为C—O伸缩振动吸收峰；803 cm⁻¹处的吸收峰为R₂C＝CHR中C—H面外弯曲振动吸收峰；770 cm⁻¹处的吸收峰为苯环上C—H面外弯曲振动吸收峰。

在¹H NMR谱图中(图 7)，首先排除谱图中的氘代氯仿的残余吸收峰δ = 7.26；δ = 12.29处较宽的单峰是羧基中氢的吸收峰；δ = 8.95处的单峰是R₂C＝CHR中氢的吸收峰，受羰基吸电子的影响，化学位移值向低场移动；δ = 7.47–7.80处是苯环氢的吸收峰，谱图中没有观察到其他杂质峰，表明产物纯度高。

结合熔点、FTIR和¹H NMR谱图分析结果，说明产物为香豆素-3-羧酸。

改进后的实验内容增加了产物香豆素-3-羧酸的紫外吸收光谱和荧光光谱性质研究，学生学习到有机物紫外吸收光谱的测试方法、影响因素及数据处理分析方法，为更深入的香豆素类衍生物的荧光性能研究奠定基础。

以不同极性的溶剂配制相同浓度香豆素-3-羧酸溶液，测得的紫外吸收光谱如图 8所示。以二氯甲烷为溶剂时最大吸收波长为301 nm，而以乙酸乙酯、二甲基亚砜、甲醇、水为溶剂时最大吸收波长均向左移动。结合溶剂的极性，比较发现随着溶剂极性的增大，最大吸收波长发生蓝移。这是由于溶剂极性增大，溶剂的偶极使溶质的极性增大，或溶剂与溶质间形成氢键，使得n → π^*能量增大，从而紫外吸收光谱出现蓝移。

由图 9可知，溶液pH = 1–3时，香豆素-3-羧酸溶液紫外最大吸收波长为300 nm。pH = 5–9时，最大吸收波长出现蓝移。随着溶液碱性继续增强，紫外吸收峰发生较大变化。

分析原因，pH = 1–3时，酸性越强，香豆素3-羧酸的羰基氧越易发生质子化。pH达到4时，羰基氧上的质子逐步电离，形成中性分子。随着pH继续增大，分子中羧基质子电离，形成—COO⁻负离子，羰基自身电子云密度增强，对芳环的吸电子作用增强，芳环共轭能力降低，表现出吸收峰蓝移。在pH达到10以后，300 nm处跃迁的最大吸收峰消失，说明溶液碱性增强，分子出现水解并打开内酯环，破坏了分子的原有共轭结构，减少结构的刚性，吸收峰发生很大的变化。

将香豆素-3-羧酸与不同金属离子以摩尔比1 : 1混合后，紫外吸收光谱数据显示(图 10)：Zn²⁺、Pb²⁺的加入未对香豆素-3-羧酸的紫外吸收产生影响；Cu²⁺和Hg²⁺的引入使香豆素-3-羧酸的吸光度明显增大，产生增色效应；而Cr³⁺的加入使得吸光度降低，有明显的减色效应；同时发现，Cu²⁺和Cr³⁺的加入产生红移现象。由此说明，Cu²⁺、Hg²⁺和Cr³⁺对香豆素-3-羧酸的紫外吸收有一定影响。

将香豆素-3-羧酸与不同金属离子以摩尔比1 : 1混合后，荧光光谱数据显示(图 11)，加入不同种金属离子后，均出现荧光猝灭现象：Pb²⁺和Hg²⁺对香豆素-3-羧酸的荧光仅有微小的猝灭作用；Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺对香豆素-3-羧酸的荧光有较明显的猝灭作用。

本实验以价廉易得、无毒无害的L-脯氨酸为催化剂，无溶剂条件下完成中间体的合成。加热操作采用金属浴，不涉及明火操作，控温稳定且清洁。中间体不经分离，“一锅煮”直接进行下一步反应，省去中间处理环节，既节省时间、降低成本，又提高产率。增加结构表征和光谱性质，由验证性实验改为综合、研究性实验。

改进后的实验方案绿色环保，实验路线清晰可控。在锻炼学生有机合成基本操作的同时，开拓专业视野，提高学生综合实验技能。该改进实验适合推广至大规模的高年级本科生实验教学。

通过对香豆素-3-羧酸的合成这一经典实验的改进，由表 5实验改进前后的对比可以看出，改进后的实验，由单纯的验证性实验转变为一个综合、研究性实验，在探索过程中培养学生以下技能。

(1) 在有机合成反应条件的摸索过程中，将不断探索、优化的创新思想传递给学生。学生体会到精益求精的钻研精神和坚持不懈的科研毅力。

(2) 实验以无毒L-脯氨酸为催化剂，在无溶剂条件下，采用“一锅煮”的方式进行，加深学生对“绿色化学”理念的认识。

(3) 增设了多种手段表征产物结构以及光谱性质研究，学生利用理论知识分析数据，以实事求是、有理有据、科学严谨的态度虚心学习，不断提升专业技能。