曾经在一个科研课题中，笔者使用一种双功能耦联配位剂L将稀土元素M标记到待测DNA序列上，通过测定M的含量对DNA进行间接定量^[1]。如图 1所示，L作为桥梁将DNA分子与稀土元素以1 : 1的比例连接在一起，理论上产物中二者的浓度是相等的。论文投稿后审稿人提出了这样一个问题：如何定量地证明标记产物与理论预期相符？参考相关文献后笔者利用微量核酸分光光度计(NanoDrop)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分别对产物中DNA和稀土元素的浓度进行了测定，以验证用稀土元素的含量对DNA定量的可行性。但实际上，检测时必然存在一些误差，即使对于同一样品，NanoDrop和ICP-MS测得的浓度值并不能做到完全一致(如表 1，为对6个标记产物的测定结果)。测量得到的数据之间存在差异不可避免，但对于两组(或多组)略有差异的数据，简单地认为“它们相等、标记产物符合理论预期”显然不够严谨。那么又该如何用客观的数据、科学的方法来回复审稿人的问题呢？

我们的目的是证明NanoDrop与ICP-MS两种方法所得数据的一致性，因此问题就转变为：数据间的差异究竟是随机误差引起的还是由于DNA与稀土离子本身浓度就不相等(标记产物存在问题)？在分析化学中，这样的问题可以通过显著性检验来解决。中文教材所介绍的t检验法针对的对象是“不同分析人员、不同实验室或同一分析人员采用不同方法分析的同一试样”^[2]，这并不适用于当下分析多个被标记DNA样品的情况。而英文教材中对于显著性检验的讲解更为全面，其中的配对t检验法(paired t test)适用于“两种方法分析一系列不同样品”的情况，帮助笔者顺利地解决了审稿人提出的问题。

在《化学统计学》一书中，显著性检验定义为：关于总体的假设称为统计假设，检验统计假设的方法称为假设检验；如果只提出一个假设而统计的目的仅仅是判定这个假设是否成立，并不同时研究其他假设是否成立，则称这种假设检验为显著性检验。两总体在某一参数上一致的假设称为零假设H₀ (不存在显著性差异)，同时提出备择假设H₁ (存在显著性差异)，如果舍弃H₀而接受H₁，则零假设H₀就是虚设的^[3]。

分析化学中常根据数据的平均值对测定结果进行显著性检验，从而对分析方法、分析人员、被分析物等影响因素进行评价。对H₀、H₁两种假设的取舍通过对数据提供的信息进行分析来实现，这一过程可以根据数据类型的不同(非配对数据：unpaired data；配对数据：paired data)分为两种情况，即非配对t检验和配对t检验。英文教材给出了以下两个例子来帮助理解配对数据与非配对数据的概念^[4]：

例1：收集10枚相同面值的硬币，依次使用2台天平对它们逐个称重所得的数据；

例2：收集10枚相同面值的硬币并随机将它们分为两组，每组5枚。先使用一台天平对其中一组硬币称重，再使用另一台天平对剩下一组硬币称重所得的数据(注意不存在被称量2次的硬币)。

例1中得到的数据是配对数据，对于每台天平，都使用了相同的10枚硬币来评估。例2中得到的数据则属于非配对数据，对于每台天平，使用了不同的硬币样本来评估。实际上，如果两组数据的样本数不相等则必然是非配对数据，两组数据的样本数相等则可能是配对数据也可能是非配对数据。

在分析化学中常常将理论真值、计量学约定真值或相对真值视为真值(标准值)^[2]来处理。t检验法可以比较数据的平均值$ \bar x $与标准值μ之间是否存在显著性差异。首先从样本的数据信息求得标准偏差s，再根据表 2中公式2-1计算得到的统计量t进行检验，其中n为平行测定次数。当计算值小于t值表中相应置信度、自由度(n − 1)下的t值时选择接受零假设H₀，反之则拒绝H₀并接受备择假设H₁。

相对于上述与标准值的比较，在实际工作中，两组数据间平均值的比较更为普遍、应用面更广。这类比较可以是不同分析方法(仪器)之间的、不同分析人员之间的、不同批次被分析物之间的等等，其数据来源往往是对同一样品的多次重复测定(两组数据的样本数可以相同也可以不同)。

两组数据间是否存在显著性差异并不仅仅取决于它们的平均值，也与它们的数据分布宽度(标准偏差)有关。因此，首先需要通过F检验来考察两组数据的标准偏差s之间是否存在显著性差异。由表 2中公式2-2计算统计量F，其中$ s_1^2 > s_2^2 $，根据其与F值表比较得到的检验结果，后续对应有两种方法对两组数据的平均值进行比较。

当两组数据的标准偏差间不存在显著性差异时，将二者的标准偏差合并，记为s_合并(表 2公式2-3)，然后计算出统计量t(表 2公式2-4)，再查询t值表进行判断(此时t检验对应的自由度为$ {n_1} + {n_2} - 2 $)。

当两组数据的标准偏差间存在显著性差异时，不能将s₁、s₂合并计算。但我们仍然可以基于零假设H₀ (两组数据间不存在显著性差异，即μ₁ = μ₂)，根据表 2公式2-5分别计算μ₁和μ₂，联立μ₁和μ₂推导出统计量t的定义式(表 2公式2-6)。由此计算出的统计量t所在的自由度由表 2中公式2-7得到，取距离f计算值最近的整数^[4]。不过这种情况的讨论在大部分教材中都被忽略了。

配对t检验法即所谓的第三种t检验法，是被许多分析化学教材所省略的一种重要的显著性检验方法。“使用两种不同的分析方法对一系列不同的样品进行测定，并根据结果对两种分析方法进行评价”是配对t检验法在分析化学中最常见的应用场景。在这种情况下，其数据来源是两种分析方法对多个不同样本的成对测定(两组数据的样本数必然相同)，而这些测量值(如质量、浓度或pH等)往往具有较为宽广的分布。我们的目标是查明两种分析方法之间是否存在显著性差异，因此成对的样本数据能够使我们更加专注于每一对数据之间的横向差异，避免被样本之间存在的相对较大的纵向差异所干扰。

对于配对数据，我们首先计算出每一对数据间的差异$ {d_i} $ (注意这里的差值计算是有方向性的，即$ {d_i} $的值有正负之分)，并由此得到差异的平均值$ \bar d $及其标准偏差$ {s_d} $。两组数据平均值的差异$ {\bar x_1} - {\bar x_2} $等价于每一对数据内差异$ {d_i} $所构成样本的平均值$ \bar d $^[5]，因此根据我们的检验目标，可以将零假设H₀记为$ \bar d = 0 $，并由表 2公式2-8计算相应的统计量t。式中n为成对的样本数，统计量t所在的自由度$ f = n - 1 $。

在日常的分析化学教学中，数据处理与分析的内容大多来自于数理统计学。由于其较高的难度以及繁多的理论讲解，学生们往往会觉得枯燥难以掌握而逐渐忽视这一部分内容的学习。但在实际工作中，数据的处理与分析是分析化学家最为基础最为重要的能力之一，要获得准确无误的结果就离不开正确的数据处理方式。

t检验法本身在统计学中也是一个理论性很强的概念，有着各种形式的统计量和公式伴随其左右；在化学、生物学、医学、药学等领域也有广泛的应用，尤其适合于解决实际的生产问题。国内经典的分析化学教材都只用简短的篇幅介绍了非配对t检验法，所提供的例题往往缺乏情景深度以及知识联动。相反，英文教材对这方面的教学内容颇为重视，不仅理论知识点讲解得全面(包括配对与非配对t检验法)，配套的例题也都带着浓厚的分析化学气息。

这其中最为经典的例子就是Lord Rayleigh因发现稀有气体氩气而获得1904年诺贝尔物理学奖。Rayleigh使用了两种不同的方法制取了等体积的氮气并在恒温恒压下称量其质量：一种是将空气通过灼热的铜网除去氧气而得到氮气(A组)；另一种是通过化学方法分解氮氧化物(如N₂O、NO等)得到氮气(B组)。其中A组共7个样品，质量平均值2.31011 g；B组共8个样品，质量平均值2.29947 g。由空气制得氮气的平均质量比由氮氧化物制得氮气的平均质量高0.46%，Rayleigh认为这大大超出了他实验操作时所能产生的随机误差，便意识到由空气制得的氮气中可能还混有相对分子质量更大的气体，最终成功发现氩气^[6]。介绍到这里，教材就自然而然地引出F检验法以及t检验法来验证这两组气体的质量数据间确实存在显著性差异。这是一个典型的非配对t检验的例子。在这样一个生动的诺奖故事中，学生们不仅学习到了理论的知识点，也了解到这些知识的实际应用，更能体会到科学研究中求是严谨、一丝不苟的态度：对数据的准确测量非常重要，但仅有准确的数据是不够的——对采集到的数据必须进行仔细科学的分析。

此外，除了经典、生动，例题的全面性也很重要。同一个知识点在实际中可能会应用于多种情境，覆盖面更广的示例才能够帮助学生加深印象，融会贯通。例如t检验法在用于非配对数据的两组平均值比较时，最常规的情况是使用一个样品(重复测定多次)来比较两种不同的分析方法。除了这种情况，使用同一种分析方法来比较两组平行的样品也是可行的，这在实际生产中能够实现对不同批次产品的检验。以此类推，两名分析人员使用同样的分析方法多次测定同一个样品所得的结果，也可以利用t检验法来比较操作者之间的差异^[7]。当然，在这些例题中，两组数据所包含的样本数n₁和n₂可以设置成相等或不相等，这样学生们就能想到非配对数据的样本数未必相等。

对于科研工作者尤其是生物、医学方向的科研工作者来说，在实际工作中遇到更多的是配对数据的情况。在生物统计学中是这样描述配对t检验法的：若两组数据样本是由同类个体在不同时间或不同部位取得的，且个体间的差异又大，此时宜采用配对t检验法进行鉴定^[8]。例如，欲比较人体左右手臂的血压是否相同，每个人的左手血压作为第一样本，右手血压作为第二样本，两个样本血压结果是由同一个体获得的，且个体间年龄、性别、体质状况各异，因此采用配对t检验法来消除个体间的差异。又如，同一人采取坐姿与卧姿时的血压的比较，肾病患者在药物治疗前后的排尿量的比较，哮喘患者在寒冷冬季散步前与散步后峰呼气流速的比较等等，都属于配对数据的例子。在这些例子中，由于生理指标检测的即时性要求以及患者生理状态的时时变化，对一个样本往往只采样(检测)一次，这也是配对数据的特点之一。

配对t检验法在分析化学领域同样应用广泛，但使用形式与生物、医学中的略有差异，以对新旧分析方法的比较为主。前文所述非配对数据情况下两种分析方法的比较限制了分析样品为同一个(例如仅能在一个固定浓度对两种方法进行比较)，而配对t检验法可以通过分析两种方法对多个不同浓度样品的测定结果来完成。在实际的研究工作中分析方法的适用范围尤为重要，因此通过配对t检验法得到的结果会更具有说服力。英文教材中给出的实例大都围绕着时下热门的生化检测展开，比如血液样品中血尿素氮、葡萄糖，植物组织提取物中硝酸盐含量的测定等。在这些实例中大多采用新开发的电化学、光化学检测方法(代表着快速、高效)与传统的检测方法(代表着标准)对比，以此来考察新方法的可靠性。在引言的示例中，笔者也是通过配对t检验法对标记产物的NanoDrop和ICP-MS (两种分析方法)测定结果间的差异进行了评价。根据表 1中的数据求得平均差值$ \overline d $为0.117 (n = 6)，进而求得d的标准偏差$ {s_d} = 0.523 $(表 2中计算式3-1)，故统计量t = 0.546 (表 2中公式2-8)。查阅t值表知，在95%置信水平、自由度f为5时，统计量t的临界值为2.57，大于本实验中求得的t值。这一结果表明NanoDrop和ICP-MS测得的数据间不存在显著性差异，从而验证了产物与理论预期相符。

当然，在分析化学课程的教学过程中，由于受到教学时数的限制，教师在课堂上很难对某个知识点做过多的延伸拓展。因此在强调教材知识体系的完备性之余，我们还应该考虑实际课堂教学的可行性，即如何把有关t检验的拓展内容融入到有限的课堂教学中。为此，我们提出以下建议和设想：教师在授课时首先重点讲解基本的显著性检验的内容，3种t检验的方法过程；除了基本例题外(比如Rayleigh的气体实验)，可以更多地把这部分知识穿插到课后习题中去，并让学生比较配对t检验和非配对t检验的异同、应用场景，留给学生一定的自主学习空间，培养学生的独立思考能力。另外，也可以考虑以开放式的探究性实验为载体，将这部分内容引入分析化学实验课程，加强学生对实验数据的处理，理论与实践相结合的方式更容易激发学生的学习兴趣，也使我们能更加顺利地达成教学目标。

对于分析化学学科的学生和科研工作者来说，学习与数理统计相关的知识内容时往往会因为教材的理论内容不能与实际相联系而感到枯燥难学^[3]。要把“t检验”这样一个经典的统计学方法从非配对t检验到配对t检验完整地呈现给一个化学背景的学生不是一件容易的事，只靠背诵千篇一律的公式、记忆苍白无力的例题是远远不够的。对于分析化学教材而言，也不能一味精简“t检验”的内容，回避理论而抽象的知识点。利用分析化学与实际紧密联系的学科特色，从分析化学学科的实际问题出发，以真实有效的数据为基础，通过解决问题的过程循序渐进地引出相应的统计学知识，最后再以多角度、多种形式的实例拓宽视野，这才是“t检验”内容在分析化学教材中应有的编排方式，才能更好地帮助学生理解收集数据后科学分析的重要性。无论是内容的完整性还是例题的实用性，国内现有的分析化学教材都还可以进一步完善。因此，分析化学教材建设需要以“学习知识的目的是希望将来能利用知识来解决问题”为理念，继续为提高教材的科学性和可读性而努力。