为了满足高等农、林院校相关专业对化学实验的教学需求，加强学生对农、林生产中实际样品的分析过程的认识，激发学生的自主探索和创造能力，将教师个人的科研成果^[1]和实验教学结合起来，在分析化学实验中开设了与农林学科相关的综合实验项目。

超声波法^[2]与常规的溶剂提取相比，具有作用时间短、条件温和、提取率高、提取物的结构不被破坏等优点，已广泛用于天然植物的有效成分提取。构树(Broussonetiapapyrifera (L.) Vent.)为灌木类桑科植物，构树叶中黄酮类化合物含量较高，为主要活性物质^[3]。本实验选用构树叶为样品，采用超声波辅助乙醇溶液提取其中的黄酮类化合物，然后采用硝酸铝分光光度法测定黄酮含量。实验中将植物有效成分的提取、分离操作，定容、移液等定量分析基本操作，以及分光光度法的相关操作加以综合运用，训练学生的综合实验能力，为大学化学实验课程的改革提供参考。

(1)超声波法提取构树叶中的黄酮类化合物。

(2)用分光光度法测定构树叶中黄酮类化合物的含量。

(3)学习分光光度计的使用方法。

超声波法是利用超声波产生的空穴化效应、强烈振动、粉碎等作用，破坏植物的细胞，使细胞中的有效成分释放出来，直接与溶剂接触并溶解在其中，从而提高提取率。一般情况下，超声波的作用时间、超声功率与提取效率成正相关。

本实验采用超声波辅助乙醇溶液提取构树叶中黄酮类化合物以增加提取效果。

黄酮类化合物(flavonoids)的基本骨架是2-苯基色原酮，其母核含有碱性氧原子，又含有碱性羟基(图1)。此外，它还常与糖结合成苷。因此能与某些还原试剂产生颜色反应，与某些金属离子及其他一些试剂生成有色配合物。

本实验参考药典^[4]收录的方法，采用硝酸铝分光光度法测定黄酮含量：用亚硝酸钠将黄酮类化合物还原后，与硝酸铝溶液反应，在碱性条件下生成明显的橙红色配合物，于500–510 nm波长处用分光光度法测定吸光度。

实验中用芦丁对照品配制标准溶液，绘制标准曲线，以此求得构树叶提取液中黄酮类化合物的含量。

主要仪器：FA2004型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，DZF型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，KQ3200DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，721型分光光度计(海菁华科技仪器有限公司)，SIGMA 3K15型高速冷冻离心机(北京五洲东方科技发展有限公司)，减压过滤装置(真空泵、抽滤瓶、布氏漏斗等)。

材料和试剂：芦丁标准品，乙醇、NaNO₂、Al(NO₃)₃、NaOH为分析纯。构树叶，9月采集于北京林业大学校园内，在室内自然干燥后，于冰箱冷冻层保存备用。

准确称取芦丁对照品0.0208 g，用50%乙醇完全溶解后转入100 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，配成0.208 mg·mL^-1的芦丁标准储备溶液。

洗净6个50 mL容量瓶，进行编号，分别吸取芦丁标准液0.00、5.00、8.00、12.00、15.00、20.00 mL于1–6号50 mL容量瓶中，分别加入5% NaNO₂溶液2.5 mL，放置6 min后，加入10% Al(NO₃)₃溶液2.50 mL，摇匀后放置6 min，再加入4% NaOH溶液20 mL，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀后放置12 min，得不同浓度的配合物。用1 cm比色皿，以不加芦丁的溶液做空白(1号)，用5号溶液进行紫外可见光谱扫描(在460–550 nm波长范围内，改变入射光波长，测定各吸光度。注意：在490–520 nm范围内，每隔5 nm测定一次吸光度，其余波长范围内，每隔10 nm测定一次吸光度。每次改变波长，均需用空白溶液调零)，确定芦丁最大吸收波长。在最大吸收波长处分别测定不同浓度标准系列溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标(y)、芦丁质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线。

准确称取1.5 g左右粉碎的干构树叶放入250 mL锥形瓶中，以50%乙醇为溶剂，料液比为1 : 30 (g : mL)，在50 ℃下超声提取30 min；减压过滤、除去滤渣，得到提取液，定容至100 mL。取部分滤液于离心管中，进行离心分离。

分别取6.00 mL已经离心分离过的提取液于2只50 mL容量瓶中，按照“实验步骤4.1”的方法加入显色剂及辅助试剂，用50%乙醇定容，摇匀。用1 cm比色皿，以不加芦丁的溶液做空白(步骤4.1中的1号溶液)，在最大吸收波长下，分别测定黄酮类化合物的吸光度。

根据标准曲线得到样品溶液中黄酮的质量浓度，按式(1)计算构树叶样品黄酮类化合物的提取率：

(1) $黄酮类化合物提取率= t\frac{{\rho V \times {{10}^{ - 3}}}}{m} \times 100\% $

式(1)中，ρ为样品溶液中黄酮的质量浓度(mg·mL^-1)，V为样品溶液体积(mL)，m为样品质量(g)，t为稀释倍数。

以不加芦丁的试剂溶液做空白，用0.0624 mg·mL^-1的芦丁标准溶液(5号溶液)进行紫外可见光谱扫描，得到芦丁的吸收曲线，如图2所示。由图2可知，波长为510 nm时吸光度最大，说明在相同条件下在此波长下测量吸光度的灵敏度最高。因此选择510 nm为测量波长。

按4.1节方法配制6个系列芦丁标准溶液，测定各溶液的吸光度，得到芦丁标准曲线(图3)。将标准曲线用最小二乘法作线性回归，方程为y = 10.487x，R² = 0.9986，说明在0.0200–0.0900 mg·mL^-1的浓度范围内吸光度与芦丁浓度呈良好的线性关系。

按照4.2节方法提取构树叶黄酮并测定提取液的吸光度，利用芦丁标准曲线得到提取液平均浓度为0.398 mg·mL^-1，代入式(1)计算出构树叶黄酮提取率为2.64%。

实验中，为了将实验控制在4–5学时内完成，将提取时间由40 min (最佳提取时间)缩短为30 min；为了节约构树叶，实验中只称取1.5 g左右的样品粉末，使得构树叶黄酮提取率没有达到最高。这并没有影响我们的教学效果，反而使学生意识到：需要探索提取条件以得到最佳工艺条件，只有在最佳条件下才能获得最大提取率。

本实验涉及实验内容较多，实验课上一般将学生分为2–3人一组，20–40人(一个班)的一堂课需4–5学时完成实验。根据前几届学生的实验操作情况，实验指导教师需注意以下几点：

(1)构树叶需在每年9月份采集(不能是落叶)，此时树叶中黄酮含量最高。可以提前布置任务，由每个班的班长组织同学采集树叶。

(2)构树叶应在阴凉、干燥、通风的环境中自然风干，然后储存于冰箱中。在实验前将树叶粉碎成粉末，备用，可以由每个班的班长安排同学完成。

(3)黄酮类化合物不稳定，在提取、检测等过程中，应尽量避免光、热，并尽可能缩短实验时间。

(4)实验中所用的芦丁标准品和NaNO₂不稳定，需现配现用。

本实验是科研转化成教学的综合化学实验，整个实验过程主要包括构树叶的采集、样品的前处理、黄酮的超声波辅助提取以及分光光度法测定。该综合实验将有效成分的提取技术、化学分析方法以及仪器分析方法加以综合应用。从2015年起至今，在本校分析化学实验课程中，面向林产化工、制浆造纸工程、环境科学、环境工程等专业的两百多名学生开展本实验，学生的结果合理。该实验是一个适合低年级本科生的综合化学实验项目。

实验中将物质的提取、分离操作，定容、移液等定量分析基本操作，以及分光光度法的相关操作加以综合运用。通过这个实验，学生能够得到多方面的综合训练，掌握多种仪器的使用方法，提高学生的创新能力和实验操作技能。选取植物样品，研究其中生物活性成分，有利于加强学生对农、林生产中实际样品的分析过程的认识，培养学生运用化学理论知识解决实际问题的能力，满足高等农、林院校相关专业对化学实验的教学需求，为学生进行后续专业实验课的学习、毕业论文设计奠定扎实的基础。

根据教学目标，可设计如下思考题：

(1)采用硝酸铝法测定黄酮类化合物时，为什么需要加入NaNO₂和NaOH？

(2)测定吸光度时，是否每次测量均需要用参比溶液重新调整仪器？用参比溶液调零的目的是什么？

(3)用本方法测定构树叶黄酮类化合物的含量时，有哪些注意事项？