咖啡因(caffeine)是从茶叶、咖啡果中提取出来的一种黄嘌呤生物碱^[1]，化学名为1, 3, 7-三甲基黄嘌呤，属于一类中枢神经兴奋剂，适量食用有助于提神、去疲劳，因此含有咖啡因成分的能量饮料十分畅销。但由于咖啡因具有刺激中枢神经的功能，长期或过量食用对人体有害且易成瘾。因此对饮料中咖啡因含量快速、准确的测定，有助于人们科学合理地摄入相关产品。

用于检测咖啡因的分析仪器有多种，目前报道的主要有紫外光谱法、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)及液相色谱串联质谱法(LC-MS) ^[2–4]等，这些方法检测时间均较长，而且在样品前处理中，都需要使用较多有机溶剂，对环境和和操作人员健康不利。

超高效合相色谱法(Ultra Performance Convergence Chromatography，UPCC或UPC²)利用超临界二氧化碳(CO₂)与少量有机溶剂(甲醇、乙醇等)为流动相，通过调节有机溶剂的比例及系统反压，使流动相的极性和密度发生变化，从而控制样品的分离效果。其优点是用无毒的CO₂代替了有毒的挥发性有机溶剂，不仅减少废液处理环节、节省成本，而且可降低对环境和实验人员健康的危害^{[5, 6]}。目前，许多色谱技术(如GC、HPLC、LC-MS等)已被广泛应用于生命科学研究及临床医学测试中，而UPC²作为一种新型色谱分离技术，不仅拓展了气相色谱、反相高效色谱技术的局限性，能完全代替正相色谱技术，而且具有快速、高效、绿色环保及分离能力强的优点^[7]。将UPC²应用于仪器分析实验教学，符合培养高素质、综合能力强的医学人才的需求。

本实验选用生活中廉价易得的三种饮料，采用UPC²测定其中咖啡因的含量，同时涉及称量、溶解、定容等多项分析化学的基本实验操作，内容贴近生活，能激发学生的实验兴趣，适合一年级医学生仪器分析实验要求。本实验将化学分析与仪器分析的内容有机结合，使学生在掌握UPC²原理和操作技能的同时，能对所学知识进行梳理和总结，利于培养学生的实践能力和创新思维^[8]。

仪器：超高效合相色谱仪(ACQUITY UPC²，美国Waters公司)，XS105电子分析天平(Mettler Toledo，瑞士)，USC-302超声波清洗仪(上海波龙电子设备有限公司)，色谱柱(ACQUITY UPC^2TM BEH柱3.0 × 100 mm，1.7 µm)。

试剂：咖啡因标准品(上海试剂二厂，纯度≥98%)，可口可乐(500 mL)，统一绿茶(茉莉味，低糖，500 mL)，三得利乌龙茶(无糖，500 mL)，甲醇(TEDIA，HPLC级，美国)，二氧化碳(食品级CO₂，上海成功气体工业有限公司)。

(1) 准确称取咖啡因对照品约10.00 mg于100 mL的容量瓶中，加70 mL甲醇，超声溶解后，再用甲醇定容、摇匀，得浓度为0.1 mg∙mL⁻¹的溶液。移取此溶液5 mL于50 mL的容量瓶中，甲醇稀释定容、摇匀，得浓度为10 μg∙mL⁻¹的储备液。

(2) 使用移液枪分别移取可乐、绿茶、乌龙茶各0.5 mL，分别置于3个10 mL的容量瓶中，加入甲醇稀释定容、摇匀，即得样品溶液供测试用。

本实验分组进行，每个大组6人共同完成色谱条件优化、系统适应性考查及精密度实验。每个大组再分为2小组，每组3人合做一条标准曲线，并测定三个饮料样品。本实验为3学时。

考虑到柱温、流速、系统背压等条件的变化对样品的分离影响不大，因此本实验只考查流动相组成配比对分离的影响。色谱柱：ACQUITY UPC^2TM BEH柱(3.0 × 100 mm, 1.7 µm)；流速：1.5 mL∙min⁻¹；检测波长：272 nm；柱温：25 ℃；系统背压2000 Psi；进样量：1 µL；采集时间2 min。选用CO₂-甲醇的流动相配比分别为85 : 15、90 : 10、95 : 5，用乌龙茶作为样品进行测试，通过对咖啡因色谱峰的保留时间、峰高、对称性、与杂质峰溶剂峰的分离度等考查，确定最佳流动相的配比。

从UPC²色谱图上可知(图 1)，CO₂-甲醇的配比为90 : 10时，咖啡因色谱峰保留时间约为0.82 min (其中0.39 min为溶剂峰)，保留时间合适、峰型对称，理论塔板数高，溶剂甲醇对样品测定无干扰，因此，90 : 10为最佳流动相配比。

在此优化的流动相配比下(90 : 10)，分别注入纯甲醇、咖啡因标准品溶液及样品溶液，根据所得色谱图，可以发现三种饮料的溶剂峰、杂质峰和咖啡因主峰完全分开，不干扰测试，符合定量分析的要求(图 2)。

在优化色谱条件下，取浓度为10 μg·mL⁻¹的咖啡因溶液连续进样5次，计算5次的色谱峰保留时间和峰面积的相对平均偏差值(RSD)，用于考查仪器的精密度。结果显示，保留时间的RSD为0.086%，峰面积的RSD为0.75%，表明仪器精密度达到测试要求(图 3)。

通过PDA检测器扫描后，从色谱图上提取咖啡因的紫外光谱图，得最大吸收波长为272 nm (图 4)。

将咖啡因储备液稀释为近似浓度0.5、1、5、8、10 μg∙mL⁻¹的系列标准溶液(标准液实际浓度见表 1)。在优化色谱条件下分别进行测定，以浓度X与对应的色谱峰峰面积Y进行线性拟合得回归方程。结果显示，在0.5–10 μg∙mL⁻¹浓度范围内，咖啡因浓度与对应的峰面积值之间的线性关系良好(图 5)。应用Excel软件获得回归方程：Y = 1627.1X + 189.47，R² = 1。

根据三种样品溶液分别进样后获得的色谱图，将色谱峰峰面积代入回归方程，即可计算溶液中的咖啡因含量，再通过换算即可得出饮料中咖啡因的含量。

由于UPC²作为大型精密分析仪器，价格较昂贵，实验室只有1台。为使所有学生能充分了解和掌握仪器工作原理和操作方法，本实验采用了线上线下混合式的教学模式。在实验开始前2周，要求学生登录化学实验课程网站，观看UPC²的虚拟仿真实验视频，借助虚拟技术让学生模拟仪器操作，增加对实验仪器的感性认识。教师同时在线发布预习思考题：(1) UPC²的原理及特点；(2) 从仪器部件、被分析样品类型、流动相特点、色谱柱差异等方面比较UPC²与LC、GC的异同点；(3) 何谓超临界CO₂，超临界CO₂如何形成及其理化性质；(4) 与反相高效液相色谱相比，UPC²流动相的组成如何影响样品分离度、峰高及保留时间。引导学生充分利用网络资源，查阅文献完成相关知识点的学习，既培养了学生自学能力，又提高了学习积极性。

教学结果表明，本实验样品处理简单、快速，实验操作安全、环保，数据结果准确、可靠，仪器可操作性强，并能与仪器分析理论知识紧密结合。同时通过线上线下混合式教学模式，学生事先对仪器结构及操作方法了解充分，使其能在规定的实验课时内，顺利完成所有测试工作，并获得实验数据。

本实验要求每个学生单独完成一份实验报告，报告中除了基本实验内容外，还有预习思考题的回答、实验过程的讨论等，可以提高学生分析、归纳、解决问题的能力。我们针对参与实验的三届学生(预防专业)共90人发放问卷调查，结果显示，对实验效果的总体满意率达92% (图 6)。

以往HPLC、GC等分析化学实验，由于这些大型精密分析仪器价格昂贵而数量少，受实验时间所局限，实验时往往由教师开机后完成实验参数设置、仪器平衡等操作，而学生只能做最后进样的简单操作来获取数据，限制了学生对仪器本身了解的机会，也限制了学生的好奇心和创新能力的培养。

相比较而言，使用UPC²测定时，由于平衡时间短、出峰时间快，1.5 min即能完成一次样品测试，所以在教师指导下学生可以参与仪器操作的全过程，使学生真正体会到仪器分析实验的乐趣^[9–13]。本实验操作涉及色谱图的叠加比较、紫外光谱图提取及3D图的观察，并运用Excel软件获取回归方程及精密度的计算等，这些知识的学习能为学生今后撰写论文和制作图文并茂的PPT打下基础。

本实验首次采用超高效合相色谱作为分析手段，具有操作简单、快速高效、绿色环保等优势。由于UPC²具有绿色环保的特点，教学中我们还将“青山绿水就是金山银山”的环保理念贯穿于其中，使思政教育和教学过程有机结合。