有机化学实验是高等学校化学及相关专业的重要必修课程，是一门结合基本理论的实践课程^[1]。在教学中融入科研及创新综合教育、转变教学理念、增加联系科技前沿的创新性综合实验，有利于增强学生的创新能力、提升学生的学科素养，也有利于培养新时代所需要的应用型人才^{[2, 3]}。

随着高校教学改革的深入及创新意识的加强，有机化学实验课程改革也是势在必行。基于创新型人才培养的需求，有机化学实验教学改革成为培养应用型、高水平的综合性人才的重要举措。传统有机化学实验的教学目的是让学生掌握实验基本操作和基本实验技能^[4]，而对有机化合物的光谱鉴定方法和实际应用等方面的重视程度不够。随着社会的发展，对应用型和具有创新意识的全方位人才的需求越来越迫切，使得传统的有机化学实验教学模式已不能满足人才培养的需要。为使学生能够更好地适应现代科学技术的发展^[5]，有机化学实验教学中应适当引入最新的科研成果，并结合有机化学基本理论设计多种适用于本科有机实验教学的综合性实验，使有机化学实验充分发挥其学科特有的桥梁作用。

螺吡喃及其衍生物是一类最具代表性的光敏有机化合物，因其在可再写纸、光控开关及传感器等方面的潜在应用而引起了广泛关注^{[6, 7]}。螺吡喃及其衍生物在紫外/可见光激发下可以发生螺C―O键的断裂和重新结合，从而导致螺环发生“开环/闭环”的结构变化^{[8, 9]}。当螺吡喃类化合物(SP)受到紫外光照射时，分子中螺环上的C―O键断裂，生成开环的、极性增强的部花青化合物(MC) ^[10]，开环之后整个分子转变为连续共轭结构，因此在可见光区有吸收并伴随着相应的颜色变化；而当部花青分子受可见光照射后^[11]，C―O键重新结合，形成闭环的、非极性态的螺吡喃分子，而且颜色也恢复成原来的无色^[12]，正是基于此光之异构化特性，使得螺吡喃分子具有开发成防伪墨水的潜在应用。螺吡喃及其衍生物合成原料简单便宜，所用试剂毒性较低且实验时长适宜，这些优势使其更适合作为理论与实际应用相结合的创新型综合实验教学内容。

综上，本综合实验设计以1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物和5-硝基水杨醛为原料，通过一步反应直接合成出一种具有光致异构化特性的螺吡喃分子，该反应机理涵盖了亲核加成、分子内消除和O-烷基化三个过程。实验过程涵盖了固液分离、薄层层析、柱层析等有机合成基本操作，通过核磁共振氢谱、紫外光谱的表征，最后将产物应用于防伪墨水。此实验设计将有机物的“制备–提纯–表征–应用”融为一体，注重培养学生使用现代仪器对产物进行结构分析的专业科研能力，通过产物在防伪墨水中的应用拓宽学生科研视野、激发科研兴趣、加强学生主动挖掘有机分子在生活中应用的意识、提升他们的有机化学学科素养和社会责任感。本实验设计是适应时代发展潮流的整体性教学改革^[13]，有利于培养专业知识扎实、全面，同时创新能力强的应用型人才^[14]。

(1) 了解螺吡喃类化合物光致异构化的原理及应用领域。

(2) 掌握1’, 3’, 3’-三甲基-6-硝基螺[苯并吡喃-2, 2’-吲哚啉]的制备方法。

(3) 掌握薄层色谱法的基本操作及旋转蒸发仪、紫外-可见分光光度计的使用方法。

(4) 掌握柱色谱法的基本操作及核磁共振波谱仪、紫外分析仪的使用方法。

1’, 3’, 3’-三甲基-6-硝基螺[苯并吡喃-2, 2’-吲哚啉]是一种螺吡喃类化合物，以1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物和5-硝基水杨醛为原料、三乙胺为催化剂，通过一步反应即可合成出来，合成路线如图 1所示。实验所需药品、仪器在表 1和表 2中列出。

该反应机理涵盖了亲核加成、分子内消除和O-烷基化三个过程。首先，在三乙胺催化条件下，1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物形成碳负离子；接着碳负离子对5-硝基水杨醛中的醛基发生亲核加成，通过质子转移后分子内消除脱去水分子形成碳氮双键；最后氧负离子进攻碳氮双键完成O-烷基化，形成闭环结构的螺吡喃分子。反应机理如图 2所示。

在100 mL三颈烧瓶一侧安装恒压滴液漏斗，中间装上球型冷凝管，另一侧口插上温度计，调整温度计的位置使水银球插入液面以下且不影响磁子转动，反应装置如图 3(a)所示。向反应装置中加入5-硝基水杨醛(0.75 g，4.5 mmol)、1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物(1.36 g，4.5 mmol)和10 mL无水乙醇，开启磁力搅拌使反应液充分混合，76 ℃下加热至回流。

待回流状态稳定后，取一支毛细管吸取溶液，在硅胶板上点样进行薄层色谱分析作为对比样品，展开剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液(V : V = 2 : 1)。利用恒压滴液漏斗向反应体系中滴加三乙胺(0.46 g，4.55 mmol)与5 mL无水乙醇的混合液，反应过程中保持回流。用石油醚和乙酸乙酯(V : V = 2 : 1)作为展开剂监测反应进程，每30 min监测一次。3 h反应结束，将混合物冷却至室温，待固体析出完全后，抽滤并在布氏漏斗中用少许甲醇溶液(约3 mL)进行洗涤，将所得固体放入真空干燥箱中，在30 ℃下恒温干燥至恒重。得到棕褐色固体，即1’, 3’, 3’-三甲基-6-硝基螺[苯并吡喃-2, 2’-吲哚啉]粗产物。

采用柱色谱分离法提纯粗产品，实验装置如图 3(b)所示。取少许脱脂棉(或玻璃棉)放入色谱柱底部，轻轻塞紧，关闭旋塞，将层析硅胶用石油醚调成糊状后，缓慢倒入层析柱中。用洗耳球轻轻敲打柱身，使硅胶均匀填充至整个层析柱。

向50 mL圆底烧瓶中加入干燥后的粗产品，并加入约15 mL乙酸乙酯使其充分溶解并向烧瓶加入2.00 g硅胶(约为2倍粗产品质量)，随后利用旋转蒸发仪将溶剂全部蒸干，用固体加料漏斗轻轻地把吸附粗产品的硅胶全部转移至色谱柱中。

待液面略高于硅胶时，沿色谱柱侧壁加入展开剂进行洗脱，展开剂为乙酸乙酯/石油醚(V : V = 1 : 2)。柱层析过程中可以观察到橙黄色的色带自上而下缓慢移动。每接收15 mL流出液时采用薄层色谱法监测一次，直至紫外灯下只有一个产物点时开始收集溶液，紫外灯下无产物点时停止收集。利用旋转蒸发仪蒸干溶剂后得到黄绿色固体纯产品0.99 g，产率为68%。

取10 mg上述纯产品于试剂瓶中并加入0.6 mL (含0.03% V/V TMS)的氘代氯仿配成溶液，将溶液装入核磁样品管中进行核磁共振氢谱测试。经结果分析发现，谱图出峰位置及氢的数目与目标分子一致，证明我们成功地合成出了目标分子。

取1 mg纯产品溶于5 mL乙腈溶液作为待测样品。通过365 nm紫外光照射和可见光照射的紫外光谱分析来验证螺吡喃分子的光致异构化特性。

将一定量合成出来的螺吡喃分子溶于低毒性的乙酸乙酯溶液中来模拟钢笔水，质量浓度为2.0 × 10⁻⁴ g∙mL⁻¹。选择市售的任意一款钢笔将墨水吸入，在A4打印纸上写下一行字，并用紫外光照射，观察现象。

本实验包含了有机化学中羰基的亲核加成、分子内消除脱水和O-烷基化成螺环等基本反应类型，而且将回流、抽滤、减压蒸馏和柱色谱提纯等科研基本操作与核磁共振氢谱和紫外光谱等科研表征手段相结合，非常适宜科研渗透式本科有机化学综合设计实验的教学目标。将科研技能渗透本科实验教学当中，既保证了本科人才培养的教学要求，又能满足培养创新、应用型人才的社会需求。

在反应开始时、反应开始后每间隔30 min分别取样进行薄层色谱分析，展开剂为乙酸乙酯/石油醚(V : V = 1 : 2)。经365 nm紫外光照射后发现，反应开始时硅胶板呈现两个点，上方为极淡的产物点，下方为原料点。随着反应时间的延长，上方产物点逐渐清晰，下方原料点逐渐变淡，反应3 h时原料点已基本消失，说明此时反应已进行完全。

实验发现，反应时间为3 h时，反应温度对提纯产率的影响如图 4(a)所示。随着反应温度的升高，产率大幅上升，在大约76 ℃时，提纯产率达到峰值，即68%；但当温度继续升高时，产率随反应温度升高而逐渐下降。以上结果表明，制备1’, 3’, 3’-三甲基-6-硝基螺[苯并吡喃-2, 2’-吲哚啉]的最佳反应温度为76 ℃。

实验发现，一定温度条件下，反应时间对提纯产率的影响如图 4(b)所示。随着反应时间的延长，产物经提纯后所计算的产率明显增大，在3 h时，提纯产率为68%；但在反应3 h后，产率随反应时长增加而增大的趋势减缓，3 h后的产率与3 h时相比基本保持不变。因此，从绿色化学以及本科实验时长要求等角度综合考虑，将反应时长控制在3 h左右最为理想。综上所述，制备1’, 3’, 3’-三甲基-6-硝基螺[苯并吡喃-2, 2’-吲哚啉]的最佳反应时长为3 h，最佳反应温度为76 ℃。

测试结果如图 5所示。¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 8.01 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 7.21 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 6.89 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 5.86 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 2.74 (s, 3H), 1.30 (s, 3H), 1.19 (s, 3H)。

经分析谱图出峰位置及氢的数目与目标分子一致，证明我们成功地合成出了一种螺吡喃分子。

取1 mg纯产品溶于5 mL乙腈溶液作为待测样品。通过紫外光照射和可见光照射的紫外光谱分析来验证螺吡喃分子的光致异构化特性。首先，用365 nm紫外光照射样品，溶液中的螺吡喃由闭环的形式转换成开环的部花青形式，分子结构从螺环转变为开环的连续共轭结构，从而在可见光区产生强烈的吸收，螺吡喃分子的结构变化如图 6所示。

图 7a和7b是螺吡喃在乙腈溶液中用紫外/可见光照射不同时间的紫外-可见吸收光谱，从图 7a可以看出，在最初可见光的条件下溶液在可见光范围内没有吸收，随着紫外光照射时间的延长，在波长550 nm处产生吸收并且吸光度逐渐增大，25 s后吸光度不再变大，说明溶液中的螺吡喃分子已全部开环。从图 7b可知，再经过60 s可见光照射后开环的部花青结构逐渐转变成闭环结构，其吸光度也由1.41降低到0，这说明螺吡喃化合物又全部转化成闭环的状态。这种光致异构化现象也可通过裸眼观察，从图 7c可知，产物溶于乙腈溶液最初是无色透明的，经过25 s紫外光照射后转变为蓝紫色，开环响应速度极快，再经60 s可见光照射后又恢复为最初的无色。图 7d为在紫外/可见光交替照射测试溶液时的吸光度变化。由图可知，经过紫外/可见光交替照射至少5次循环后，吸光度变化范围基本保持不变，证明所合成的螺吡喃分子具有良好的抗疲劳性能，能够在闭环非极性和开环极性两种构型之间发生多次可逆转变。

取1 mg纯产品溶于5 mL乙腈溶液作为待测溶液，用紫外光照射不同的时间，测溶液的吸光度。以ln[(A_∞−A_t)/(A_∞−A₀)]对光照时间t作图(其中A_∞、A_t、A₀分别指时间为t_∞、t、t₀时的最大吸光度)，产物开环动力学关系如图 8所示。

实验发现，溶解在乙腈中的SP-NO₂溶液在光致变色过程中，其开环动力学曲线会出现一个转折点将反应过程分为两段，折点前后分别为两段直线。其中前一段的开环动力学方程为y = −0.0117x + 0.0252，后一段的开环动力学方程为y = −0.059x + 0.6723，前一段反应速率常数较小，后一段较大。以上结果说明，溶于乙腈的螺吡喃在光致开环过程中，前期速率较后期速率慢，会出现一个临界点，即曲线转折点。一般情况下螺吡喃光致开环过程符合一级动力学过程，即开环动力学曲线基本呈一条直线，但研究表明溶剂极性会对动力学过程产生很大影响^[15]，本实验采用极性较大的乙腈溶液做溶剂，所以导致其动力学曲线出现折点。

取1 mg纯产品溶于5 mL乙腈溶液，用紫外光不断照射直至分子全部开环，将溶液放置在黑暗环境中，测不同时间下溶液的吸光度。以ln[(A_t−A_∞)/(A₀−A_∞)]对光照时间t作图(其中A_t、A_∞、A₀分别指时间为t、t_∞、t₀时的最大吸光度)，产物闭环动力学关系如图 9所示。

由图 9可见，溶解在乙腈中的SP-NO₂溶液闭环动力学曲线基本呈一条直线，经线性拟合得到闭环动力学方程y = −0.0871x + 0.9688，闭环反应速率常数为8.71 × 10⁻² s⁻¹，其线性关系很好，结果表明，螺吡喃光致闭环过程也符合一级动力学过程。

将一定量合成出来的螺吡喃分子溶于乙酸乙酯溶液中来模拟钢笔水，质量浓度为2.0 × 10⁻⁴ g∙mL⁻¹。选择市售的任意一款钢笔将墨水吸入，在A4打印纸上写下一行字，如图 10所示。左图为自然光下的图片，右为紫外灯快速照射后的图片。可以很明显的看出，在自然光下用钢笔写在白纸上的字没有任何显示，经紫外光照射后白纸上的字变为紫色而显色，利用螺吡喃化合物的这种光致变色特性，可将其用于防伪墨水的制备。

(1) 三乙胺与无水乙醇混合液应充分振荡，以免溶液挂壁影响催化剂加入量。

(2) 三乙胺与无水乙醇混合液应在体系回流状态下滴入，并使体系始终保持回流状态。

(3) 取样检测时应吸取内部溶液并用适量无水乙醇稀释，以免点板时溶液过浓影响薄层色谱分析结果。

(4) 反应结束后待反应液自然冷却至室温时再进行抽滤，否则产物未完全析出，产率低。

(5) 使用少量甲醇溶液洗涤粗产品并快速抽干，以防产品溶解。

(6) 柱层析过程中不可通过紫外灯照射色谱柱辨别产物是否收集完毕。

(7) 紫外光谱分析时，应用365 nm紫外光灯充分照射产品的乙腈溶液。

该综合实验在实验内容和实验安排上具有较大的灵活性，本实验时长为10–12 h，教师可根据该实验的特点灵活选择教学时长及教学模式。本实验既适用于整体性教学又适用于模块化教学，教师可以根据实际需求进行选择。整体性教学模式已在校内探索，每学年对一个班级(约30人)推行该实验，教学反馈良好。学生分组进行实验内容，每2人一组，可在监测反应进程期间，穿插进行柱层析实验讲解及准备、复习核磁共振波谱仪及紫外分析仪操作方法。核磁共振波谱每组均需测试，在对产物进行紫外分析时，每组至少测2个光照时间(开环或闭环)。开环/闭环动力学数据由全班紫外分析数据整合。模块化教学时，建议按照表 3安排进行，可将该实验分为两部分进行，即有机合成实验和仪器分析实验，仪器分析实验中要求实验小组完成所有核磁共振测试和紫外分析测试，每组独立分析开环/闭环动力学。

(1) 课前布置任务：查找三篇螺吡喃类化合物主要应用领域的相关文献，以培养学生查阅文献、筛选文献的科研技能；课前自主回顾薄层色谱法的基本操作及旋转蒸发仪、紫外-可见分光光度计的使用方法，以顺利完成实验任务。

(2) 将学生分组，合作完成1’, 3’, 3’-三甲基-6-硝基螺[苯并吡喃-2, 2’-吲哚啉]的制备实验，以培养学生团队合作的科研能力。

(3) 借助网络平台提供柱色谱法的操作视频及核磁共振波谱仪、紫外分析仪的使用方法，保证学生在课前有效预习。

该实验以有机化学基础反应机理为指导，综合了有机实验基本操作和表征分析手段，将有机物的制备、提纯、表征及应用融为一体，综合性较强，适应新形势下有机实验整体性教学。本实验合成产物具有独特的光致变色性质，可应用于产品防伪领域，产物实际应用性强，除本实验中防伪墨水的制备外，还可广泛应用于光学开关、传感器、离子探针、分子开关、温度指示剂、光信息储存等许多方面，极具研究价值，是多年来的科研热点之一。不仅如此，该实验教学与科技前沿成果联系紧密、合成原料简单便宜、所用试剂毒性较低、提纯产率较高且实验时长适中，这些优势使其更适合作为结合理论与实际应用的科研渗透式本科创新型综合实验教学内容。

本实验将有机化学基础实验教学与科学前沿及应用结合起来，在本科教育阶段培养化学相关专业学生既有过硬基础操作的本领又兼具综合创新能力，致力于向社会输送具有创新思维、具备科研能力的应用型人才。通过设计这样一个适宜本科教学的科研渗透式综合实验方案，既激发了学生的科研探究兴趣，同时也与科技前沿成果及实际生活应用紧密联系起来，着重培养了学生的科研能力和专业知识水平，在有机化学实验教学乃至本科实验教学方面具有深远的指导意义。