1 实验原理
1.1 酸性KMnO4-SO32−体系化学发光及碳点增敏原理
该发光体系的量子产率低，发光强度弱，直接用于亚硫酸盐检测灵敏度很低。碳点加入后可作为催化剂有效加快体系中中间体或激发态物质的生成速度，也能作为能量受体接受激发态中间体SO2*的部分或全部能量，或者直接作为发光体，大大增强化学发光。
1.2 流动注射法
流动注射分析，由Hansen和Ruzicka在1975年首次提出，是一种新型的定量流动分析技术[18]。它可以在非平衡的状态下，在液流中重现地处理样品，并进行准确的测定。蠕动泵通过一定的速度将试样和载流泵入管路，以六通阀给待测试剂定量，两者在反应器中混合同时发生反应，检测器检测到响应信号后，通过输出装置输出信号。
在样品通过分析流路时，以完全相同的方法顺序处理所有的样品，检测器所记录的是连续变化的信号(如：吸光度、电极电势)，因而不需要达到化学平衡(稳态条件)。其中，准确样品体积的注入、精确重现的定时进样，以及从注入点到位测点体系完全相同的操作(即控制或可控分散)，形成注入样品的浓度梯度，从而产生瞬间的、但可精确重现的记录信号，使得流路中的任何一点都能像稳态一样准确测量。
2 仪器与试剂
仪器：流动注射化学发光仪(西安瑞迈PM-B)、静态化学发光分析仪(本实验室自组装化学发光暗箱，其中发光强度用R105型光电倍增管(购自北京滨松电子有限公司)检测，实验信号采集用N2000型色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)、水热反应釜、烘箱。
试剂与材料：柠檬酸、乙二胺、高锰酸钾、亚硫酸钠、氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司，AR)、透析袋(截留分子量为1000 Da)、食品样品(葡萄干、红枣、燕麦片)。
3 实验内容
3.1 碳点的制备
3.2 静态化学发光测试
静态化学发光测试采用实验室自制化学发光检测器。在反应容器中加入1.00 mL 0.02 mmol∙L−1的亚硫酸钠溶液、1.00 mL 0.0204 mg∙mL−1的碳点溶液并混合均匀，通过注射器注入1.00 mL的0.10 mmol∙L−1的高锰酸钾溶液，记录发光强度与时间的关系得到化学发光动力学曲线。
3.3 流动注射分析测试及条件优化实验
流动注射化学测试仪器结构如图 1所示，A泵驱动载留水与高锰酸钾溶液经六通阀后交替流动到管路中，B泵驱动的亚硫酸钠和碳点溶液混合，上述两个溶液混合后流经底部安装有光电倍增管的检测池。光电倍增管将发光信号转换为电信号，由电脑记录下发光强度随时间的变化曲线。
图1
3.3.1 仪器参数的优化实验
实验中选择对采样速率、放大级数、光电倍增管的电压、泵速与阀速这几个仪器参数进行优化。通过改变上述仪器参数的其中一个，固定其他参数，测试参数对发光信号的精细度、峰展宽、峰高以及峰面积的影响。
3.3.2 试剂适宜浓度的探索实验
实验中采用的高锰酸钾溶液的浓度、酸的种类和碳点的浓度都会对最后的测定结果产生影响，故需测试上述条件对发光强度的影响。测试时将其他浓度固定不变，改变其中试剂浓度进行测试。
3.4 样品的前处理方法及测定
本次实验测定的样品是葡萄干、红枣和燕麦片。将烘干的葡萄干、红枣和燕麦片分别用料理机粉碎，准确称取10.00 g粉碎后的样品，加入30.0 mL 0.10 mol∙L−1的NaOH混匀，超声提取15 min后用高速离心机8000 r∙min−1离心10 min，取上清液定容至50 mL，4 ℃保存。为保证样品分析结果的准确性，在定容之前不能有样品损失。如果上清液不能完全转移，可再加入水混合均匀并离心后再次转移。分析时根据发光峰面积定量。
4 实验结果及讨论
4.1 化学发光动力学曲线
采用静态化学发光仪测定体系在没有增敏剂和加入碳点作为增敏剂时的发光动力学曲线，结果如图 2所示。在没有增敏剂时，体系的化学发光很弱；加入碳点作为增敏剂后，体系的发光强度急剧增加。
图2
4.2 仪器参数对化学发光的影响
实验中应选取恰当的采样速率、放大级数、光电倍增管高压、泵速和阀速。下面针对重要的进行说明。
4.2.1 光电倍增管电压的影响
如图 3a所示，光电倍增管的电压会影响峰高和基线信噪比。电压过小，会导致发光峰很小；电压过大则会导致基线噪音增加。本实验选用900 V为最佳电压。
图3
4.2.2 泵速的影响
泵速是指蠕动泵每分钟的转速，会影响管路中液体的流动速度。如图 3b所示，测定同一个样品时，采用不同的泵速，峰面积基本不变，而泵速会影响峰的展宽。理论上泵速越快峰的宽度越小，就越容易分辨。
4.3 反应物浓度对发光的影响
4.3.1 碳点的浓度的影响
考察了碳点的浓度对发光强度的影响，结果如图 4a所示。没有碳点时体系发光强度很小，随着碳点浓度增加，发光强度逐渐增加。碳点浓度太大时，可能会发生猝灭作用，发光强度逐步降低。因此选择发光强度最大的碳点浓度2.04 × 10−5 mg∙L−1开展后续实验。
图4
图4
(a) 0.10 mmol∙L−1的高锰酸钾和0.10 mmol∙L−1的亚硫酸钠条件下碳点浓度对发光强度的影响；(b) 2.04 × 10−5 mg∙L−1的碳点和0.10 mmol∙L−1的亚硫酸钠条件下高锰酸钾浓度对发光强度的影响；(c) 不同酸介质下的检测信号
4.3.2 高锰酸钾浓度及其酸度的影响
4.4 方法的分析性能及样品测定
4.4.1 方法的分析性能
图 5a和b分别是优化实验条件下，不同亚硫酸钠浓度的发光信号及亚硫酸钠测定的标准曲线。发光强度与亚硫酸钠的浓度在1.0 × 10−5–2.5 × 10−4 mol∙L−1范围内呈线性关系，线性方程为I = 218 + 39.8 × 106c (mol∙L−1)，检出限为7.79 × 10−6 mol∙L−1。对浓度为3.0 × 10−5 mol∙L−1的亚硫酸钠平行测定5次，RSD为3.8%。
图5
4.4.2 样品中二氧化硫的测定
表1 样品亚硫酸盐测定结果及回收率
| 样品 | 标准加入量/(mg∙kg−1) | 平均测得量/(mg∙kg−1) | 回收率/% | RSD/% (n = 4) |
| 葡萄干 | – | 34.78 | – | 5.4 |
| 31.5 | 66.02 | 99.2 | 3.4 | |
| 37.8 | 73.08 | 101.3 | 2.5 | |
| 红枣 | – | 38.9 | – | 0.9 |
| 37.8 | 76.2 | 98.7 | 4.1 | |
| 44.1 | 82.4 | 98.6 | 3.2 | |
| 燕麦 | – | 41.4 | – | 4.1 |
| 37.8 | 72.3 | 86.2 | 5.3 | |
| 44.1 | 81.8 | 91.7 | 3.2 |
4.5 碳点增敏机理讨论
5 思考题
(1) 为什么蠕动泵的转速会影响流动注射化学发光的强度？流动注射化学发光检测到的信号与静态注射化学发光的检测信号有何不同？
(2) 同为发光分析方法，与荧光分析方法相比，化学发光分析有何特点？仪器构造有什么不同？
(3) 为保证样品分析结果的准确性，在样品前处理过程中需要注意什么？在样品全部转移至容量瓶中定容之后需要注意什么？
(4) 本实验中采用什么方法验证分析方法的准确性？还有哪些方法常用于验证分析方法的准确性？
6 实验特点及教学组织运行方式
6.1 教学组织运行方式
本实验属于仪器分析综合实验，涉及到仪器分析课程中的化学发光分析法、流动注射进样技术和纳米材料的制备，适合在化学类专业高年级开设。建议分4个环节开展实验：1) 课外预习，自主学习流动注射技术，设计实验方案；2) 实验方案讨论，确定方法建立实验验证、仪器参数设置、试剂浓度确定等具体内容；3) 实验操作环节，期间需要根据实验情况调整实验方案，根据实验内容本环节可以设置为8–24个学时；4) 完成实验报告及成果汇报PPT，分享实验结果和经验，教师点评总结，知识巩固。
6.2 实验特点
本实验主要让学生学习了化学发光分析方法，掌握流动注射进样技术。通过仪器参数的优化，学习化学发光的特性、仪器构造、流动注射装置、光电倍增管的响应特点等；通过实验条件的优化，理解化学发光的原理及其影响因素；通过样品测定，学习常规的样品前处理技术；通过加标回收实验，学习分析方法准确性的验证。学生基于本实验申请到了我校的大学生创新研究项目。
7 结语
实验采用酸性高锰酸钾-亚硫酸盐化学发光体系，以廉价环保的碳量子点为增敏剂，建立了一种流动注射化学发光的分析方法用于葡萄干、红枣、燕麦片等食品中二氧化硫含量的测定。通过该实验可帮助学生掌握在同类高校中开设较少的化学发光、流动注射等分析技术的原理及应用，深入理解化学发光的原理和特性，学习样品前处理技术和分析方法准确性的验证方法。
参考文献
DOI:10.1039/D1TB01077H [本文引用: 1]
DOI:10.1002/jccs.201600883 [本文引用: 1]
DOI:10.1016/S0039-9140(03)00301-1 [本文引用: 1]
DOI:10.1016/j.saa.2015.10.039 [本文引用: 1]
DOI:10.1007/s10895-008-0313-6 [本文引用: 1]
