实验教学是人才培养中的重要环节，在化学教学中具有非常重要的意义，可以提高学生实验技能，巩固课堂所学知识，培养学习兴趣，有助于学生提高观察问题、分析问题和解决问题的能力，对于高校培养新一代创新性人才具有特殊作用^[1]。传统的仪器分析实验课设定的实验大多数是验证性的，往往要求学生按照实验教材中规定的内容和步骤来进行操作，因此在学生的认知中，会把实验学习等同于机械的重复现成实验步骤，而忽略了这些实验步骤其实是经过多次的条件探索和优化才制定出来的，因此在实际工作中当他们遇到新的问题时往往无法独立分析和解决。另外，现行仪器分析实验教材中的实验往往比较陈旧，和生产实践以及新实验技术联系不够，会导致学生的学习积极性不高。因此在大学本科化学实验教学中，开设一些与现阶段科研前沿相结合的创新性仪器分析综合设计性实验，可以提升学生兴趣和实验教学的效果，适应社会对创新应用型人才的需求^[2]。

葡萄糖是动植物生命代谢和生物合成中一种极为重要的单糖，参与到新陈代谢的整个过程并给有机体提供所需的能量^[3]，葡萄糖还是许多催化反应的中间或最终产物，因而葡萄糖浓度的快速灵敏检测在食品化学、生物化学和临床化学等诸多领域具有非常重要的意义，是仪器分析的一个重要研究课题^[4]。对于葡萄糖含量测定方法有电分析化学法^{[5, 6]}、化学发光法^[7]、分光光度法^[8]等。其中，电分析化学法由于灵敏度高、仪器简单、操作简便，在诸多葡萄糖测定方法中备受关注。以铜基电极为代表的化学修饰电极，在强碱性条件下对于糖类物质有较灵敏的响应，可以实现对葡萄糖的直接快速分析^{[5, 9]}。但是这种方法测定葡萄糖时，选择性比较差，且需要在强碱性条件下进行检测，不能应用于生命体环境和物质原液环境中的葡萄糖含量测定，因此应用受到较大的限制。此外，随着生物传感器的发展，基于葡萄糖氧化酶(GOD)研制的葡萄糖生物传感器由于选择性好和灵敏度高等优点而被广泛使用^{[6, 10]}。但是酶生物传感器一般要在电极表面上固定GOD，由于固定化酶容易失活，需要较苛刻的制备和保存条件，因此传感器的使用寿命都比较短。

结合我们自身的科研工作和文献调研，设计了铜基化学修饰电极和GOD生物传感器两种电分析化学法测定葡萄糖的综合设计实验。教师指导学生自主设计制作两种传感器，通过实验对两种方法的线性范围、灵敏度和选择性等指标进行比较，让学生选取合适的方法以实现对果汁中葡萄糖含量的测定。培养学生从实际问题出发，探索不同路径解决问题的能力。让学生对仪器分析化学的前沿研究和新型纳米材料及应用有所了解，同时学习应用Origin绘图软件对实验数据进行分析总结，培养学生数据处理能力，提升了学生的科研素养和创新意识、创新能力。本项目的实验内容具有较高的前沿性，可以作为化学专业的三、四年级本科生的仪器分析综合设计实验。

综合设计性实验要求学生在实验过程中，要进行文献查阅、制定实验方案、实验准备、定量测试、数据处理、实验总结等工作，从学科素养、技术素养、沟通合作和国际视野等方面使学生的能力得到提高。各个实验进程中的具体工作及能力培养见表 1。

电化学分析法是通过待测物质在电极上产生的电信号来实现定量测定的方法。根据产生电信号的方式不同，可以分为直接响应和间接响应两种。直接响应是待测物质在电极上可以直接发生电化学反应从而产生电信号，比如在碱性条件下，Cu被电化学氧化为CuO，CuO进一步被氧化为具有强氧化力的Cu(Ⅲ)形式(如CuOOH或Cu(OH)₄⁻)，溶液中的葡萄糖在电极上被Cu(Ⅲ)催化氧化为葡萄糖酸内酯，从而产生氧化电流，而葡萄糖酸内酯最终水解为葡萄糖酸，由此可以实现对多种糖类物质的定量测定^{[5, 11]}。而酶基葡萄糖生物传感器则是将GOD固定在电极表面，利用在适宜条件下，葡萄糖可以在GOD催化下发生如下反应：

$ \rm{葡萄糖 + O_{2} \xrightarrow{{{\text{GOD}}}} 葡萄糖酸内酯 + H_{2}O_{2} }$

葡萄糖氧化生成的H₂O₂进一步扩散到电极表面，并发生如下电氧化反应：

$ \rm{H_{2}O_{2} → O_{2} + 2H^{+} + 2e} $

由于H₂O₂电氧化产生的电流信号与H₂O₂浓度呈线性关系，而H₂O₂的生成量与葡萄糖浓度之间又存在对应关系，因此可以利用葡萄糖催化产物-H₂O₂在电极上产生的氧化电流来间接检测葡萄糖^{[6, 10]}。随着研究的深入，科研工作者又开发出了第二代和第三代葡萄糖生物传感器，它们分别利用修饰酶层中加入氧化还原介体，来降低检测电位，减小干扰，提高灵敏度；利用酶与电极间的直接电子传递，来实现快速灵敏响应^[12]。

随着纳米科学的发展，在化学修饰电极和生物传感器的制作过程中往往会加入一些特殊的微纳米材料，以提高检测的灵敏度，优化检测的条件，减小干扰。比如，金属纳米颗粒和碳纳米管具有良好的导电性、催化活性和较大的比表面积，因此常添加于电极的修饰层中，以提高检测方法的灵敏度和选择性^[13]。

综合设计性实验要求学生能够合理运用学科知识，通过查阅相关文献和资料，综合运用各种实验方法，设计出比较合理的实验方案并开展试验，从而提高学生的综合运用知识能力、实践能力、创新能力和独立解决问题的能力，并培养学生团队合作精神^[14]。因此，本项目将改变学生被动学习的现状，课前把实验内容相关的科研论文推荐给学生，做好课前学习，课上要求学生借鉴论文中的实验原理和实验方法，由学生或学生团队自主制定实验路径，然后教师和学生进行讨论，分析每条实验路径的可行性、优缺点，并开展实验验证。可以很好地激发学生的学习兴趣，培养学生独立提出问题并分析和解决问题的能力，培养学生创新意识，提升学生创新能力。这里以典型制备方法为例来加以阐述。

CHI660电化学工作站(上海辰华仪器公司)，铂圆盘电极，玻璃碳圆盘电极，饱和甘汞电极，铂柱电极，DF-101s集热式磁力搅拌器(江苏省金坛市医疗仪器厂)。

多壁碳纳米管(MWNTs，深圳纳米港)，壳聚糖(CS，from carb, Sigma-Aldrich)，葡萄糖氧化酶(GOD，Amreco)，D-葡萄糖(> 99.8%，Amreco)，其他试剂，如氯化铜，氢氧化钠，氯化钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，醋酸，无水乙醇，抗坏血酸，果糖，蔗糖均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

0.1 mol∙L⁻¹葡萄糖溶液的配制：用分析天平称取0.991 g葡萄糖放在烧杯中，溶解后定容于50 mL容量瓶中，摇匀。放置24 h，使其达异构平衡。置于4 ℃冰箱中保存。

1%壳聚糖(CS)溶液的配制：取1 g壳聚糖加入100 g水中，边搅拌边慢慢加入0.1 mol∙L⁻¹盐酸，使溶液pH约为3，搅拌3 h，将不溶的物质过滤除去，用1.0 mol∙L⁻¹的NaOH溶液调pH为5.0。

酶固定液的组成：向1%壳聚糖溶液中加入MWNTs使其浓度为0.5 mg∙mL⁻¹，超声1 h后加入葡萄糖氧化酶使其浓度为800 U∙mL⁻¹，充分混合均匀。

0.2 mol∙L⁻¹ pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液：NaH₂PO₄∙12H₂O 0.94 g和Na₂HPO₄∙2H₂O 1.73 g放入烧杯中，溶解后定容于100 mL容量瓶中，摇匀备用。

玻碳电极和铂电极在1 μm和0.05 μm的氧化铝粉末上抛光至镜面，用蒸馏水冲洗后分别在无水乙醇和二次水中超声10 min，然后用二次水冲洗干净。清洗好的电极放入0.5 mol∙L⁻¹ H₂SO₄溶液中，在−0.26 – 1.10 V电位范围内，以100 mV∙s⁻¹扫速循环扫描20圈，此时循环伏安曲线基本不变。处理好的电极用二次洗净并置于二次水中备用。

将玻碳电极置于由0.01 mol∙L⁻¹ NaCl和0.01 mol∙L⁻¹ CuCl₂组成的沉积液中，以饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，沉积电位−1.0 V，通氮气除氧15 min，沉积200 s，冲洗电极，得CuNPs/GCE电极。

用微量加液器移取5 μL制备好的酶固定溶液滴涂到铂电极表面，室温晾干，再将2 μL的2% Nafion溶液滴涂到电极表面，室温晾干，即得GOD/MWNTs/CS/Pt生物传感器。

将CuNPs/GCE电极作为工作电极，铂柱电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，置于10 mL的0.1 mol∙L⁻¹ NaOH溶液中，或GOD生物传感器等三电极体系置于10 mL的pH = 7.0的0.2 mol∙L⁻¹磷酸盐缓冲溶液中，采用计时电流法测定葡萄糖。恒定工作电位0.6 V (CuNPs/GCE)或0.7 V (GOD生物传感器)，在匀速搅拌下加入一定量的葡萄糖标准溶液，记录加入葡萄糖后的电流增量，逐渐增加加入浓度，测定对应的电流增量，平行测定三次。根据上述数据用Origin软件做图绘制葡萄糖的工作曲线。

与实验步骤4.2.4相同的实验体系，恒定工作电位，在匀速搅拌下加入0.1 mmol∙L⁻¹葡萄糖标准溶液，记录加入葡萄糖后的电流增量，然后分别加入一定浓度的蔗糖，果糖或抗坏血酸，记录电流增量的变化。

学生自主决定果汁样品中葡萄糖的测定方法。采用标准加入法对果汁进行测定，先加入200 μL果汁，测定电流增量，再分三次分别加入1 mmol∙L⁻¹的葡萄糖标准溶液，记录整个过程中的电流增量变化，平行测定三次。用Origin软件做标准曲线，由此求出果汁中葡萄糖平均含量。

汇总电流增量随葡萄糖浓度变化的实验数据，用Origin软件作图，求出线性回归方程和相关系数。GOD生物传感器对葡萄糖浓度在1 μmol∙L⁻¹到10 mmol∙L⁻¹范围内均呈良好的线性关系，相关系数为0.9974，检测限为0.5 μmol∙L⁻¹ (S/N = 3)。CuNPs/GCE电极对葡萄糖浓度在5 μmol∙L⁻¹到10 mmol∙L⁻¹范围内均呈良好的线性关系，相关系数为0.9986，检测限为2 μmol∙L⁻¹ (S/N = 3)。两种方法工作曲线的线性回归方程范围都比较宽，相关系数也比较高，但是GOD生物传感器的灵敏度较高。

加入0.1 mmol∙L⁻¹葡萄糖溶液后，产生了一定的电流增量，再在此基础上加入一定量干扰物质，测得干扰物引起的电流改变。当干扰物引起的电流变化小于等于10%的信号电流时，认为此干扰物允许存在。用电流-时间曲线测定了蔗糖、果糖、尿酸和抗坏血酸在葡萄糖的测定中可能引起的干扰情况，用GOD生物传感器测定时，1000倍的果糖、乳糖、蔗糖和10倍的抗坏血酸不干扰葡萄糖浓度的测定。而用CuNPs/GCE电极进行测定时，抗坏血酸和氨基酸均产生较大的电流，干扰严重。10倍到20倍的果糖、乳糖、蔗糖不干扰测定。由此可知，GOD生物传感器的选择性要明显好于CuNPs/GCE电极。这是由于GOD只是选择性催化葡萄糖的氧化反应，而对其他糖类物质无催化作用，并且GOD生物传感器表面的Nafion膜只与阳离子发生选择性交换，排斥抗坏血酸等阴离子向电极表面的扩散。另外，壳聚糖在一定程度上抑制了抗坏血酸等干扰物质的电化学反应，从而减小了这些电活性物质对葡萄糖测定的干扰^[6]。

采用GOD生物传感器对果汁进行测定，由绘制的标准曲线可求出果汁中葡萄糖平均含量为66.4 mmol∙L⁻¹，与高效液相色谱法结果69 mmol∙L⁻¹接近。果汁中含有抗坏血酸，但是，根据已有文献报道^[15]，果汁中的抗坏血酸含量只有4–43 mg，即0.23–2.4 mmol∙L⁻¹，含量较少，而研究表明10倍于葡萄糖浓度的抗坏血酸不干扰测定，因此果汁中的抗坏血酸对葡萄糖含量的测定没有影响。但是采用CuNPs/GCE电极得出的结果会偏高很多，这是由于果汁中除了葡萄糖还含有大量的抗坏血酸、果糖、蔗糖等物质，由于CuNPs/GCE电极的选择性不高，造成测定结果远大于葡萄糖的实际浓度。

学生在实验结束后，通过小组讨论，以科技论文的形式撰写实验报告。利用作图软件简要绘制两种电极的响应原理和制备流程示意图，并对其进行较详细的叙述；阐述实验的具体步骤，列出实验数据并分析实验结果；对比两种电分析化学法的优缺点，设想它们各自的应用限制及应用领域。

通过对本仪器分析综合设计性实验，学生可以学习到化学修饰电极和生物传感器这类新型电分析化学方法的基本原理，电极制作方法和测试手段，并且接触到碳纳米管和纳米颗粒等纳米材料的新知识，提升了学生的学习兴趣。学生在实验过程中进行实验方案设计并验证方案可行性，不断发现问题、分析与解决问题，练习科研论文写作。从而锻炼学生的创新精神和团队合作意识，提高综合科研素养。