有机实验和仪器分析实验是本科化学教学中的基础实验，也是化学实验教学中的重点内容。有机化学实验主要涉及简单有机化合物的制备、分离、纯化和鉴定等；分析化学实验主要涉及分析化学基本操作及分析测定方法等。虽然现有的有机和仪器分析实验教学内容已经十分丰富与完善，但是这些实验涉及的知识点比较单一，内容略显陈旧，缺少两者之间的联系以及与科学研究领域的结合。为了提高学生的科研兴趣，更好地培养学生的科研素养，学院鼓励教师将自己最新的科研成果设计成能够在本科生教学中实施的实验^[1]。因此，设计一个有机与分析结合的综合性实验，并将学科发展的最新科研成果引入实验教学，实现教学与科研的深度融合具有重要意义。本文通过转化仪器分析现有的实验研究成果，将“BODIPY荧光探针的合成及次氯酸的检测”转化为研究型实验。

次氯酸(HClO)是生物系统最重要的活性氧(ROS)之一^[2]，在一定的生理条件下，由髓过氧化物酶(MPO)催化氯离子和过氧化氢(H₂O₂)生成^[3]。次氯酸在生命过程中是一把双刃剑。一方面，HClO可以通过杀死入侵生物免疫系统的病原体和细菌来保护人类健康^[4]；另一方面，过量的HClO可导致组织损伤、炎症和一系列疾病。次氯酸的检测方法有很多种，如淀粉-碘化钾法、N, N-二乙基对苯二胺比色法、化学发光法、分光光度法、荧光分析法等^[5]。在这些检测方法中，荧光探针技术具有选择性好、灵敏度高、检出限低、操作简便^[6]及细胞毒性低等突出优点，使其在化学和生物分析检测^[7–10]中被广泛应用^[11]。

基于此研究背景，并结合本课题组近年来的科研成果，本实验设计并合成了一种基于分子内电荷转移(Intramolecular Charge Transfer，ICT)机制，以二氨基马来腈残基作为识别基团，以BODIPY (氟硼二吡咯)荧光染料作为荧光核，来定量检测次氯酸含量的新型荧光探针。通过荧光检测技术来测定荧光探针的动力学曲线以及荧光对次氯酸的选择性等。本实验可操作性强，内容涉及有机、分析知识的综合运用，有利于学生逻辑思维能力及科学研究思路的训练。

(1) 了解旋转蒸发仪、荧光分光光度计、旋片真空泵等仪器的基本操作。

(2) 理解荧光探针发光原理、探针结构与荧光性质之间的关系。

(3) 进一步掌握对各类谱图的解读与综合分析。

(4) 多种实验操作融合，培养学生实验动手能力、数据处理能力及查阅中外文资料的能力。

荧光探针分子按作用一般可分为三部分，即发光基团、识别基团和连接基团。BODIPY型荧光探针是以BODIPY类荧光染料作为发光基团的荧光探针。识别基团是与待检测物质发生特定作用的基团，识别基团与待检测物质作用后使其结构、性质发生一定的变化，对发光基团的荧光发射波长、强度、荧光量子产率产生一定影响，通过仪器可以检测这些变化从而判断探针分子对待测物质的响应情况。连接基团作为发光基团与识别基团之间电子迁移的“桥梁”将二者连接起来，见图 1。

BODIPY是一种性能优异的荧光染料，其结构如图 2所示。

BODIPY类荧光染料具有诸多优良的特性。其优点如下：(1) 有着较高的摩尔消光系数；(2) 光稳定性及化学稳定性强，溶剂的极性及pH等因素对BODIPY荧光染料基本不造成影响；(3) 荧光光谱的峰宽较窄，且具有稳定的光谱性质；(4) 具有多个可以添加基团的修饰位点；(5) 细胞毒性不明显；(6) 与大分子荧光探针相比分子量较小。这一系列优点引起化学工作者的关注，该类染料的研究和应用得到了迅猛的发展。同样的，BODIPY类荧光染料存在着缺陷和不足，如荧光核较短的发射波长、在水体系中溶解度较差，诸如此类的缺陷制约了它们被应用在细胞荧光中，因此，构思并筛选出好的BODIPY型荧光探针，能使其在生命科学的生物检测领域中被更为广泛的应用。

荧光探针其识别机制可分为光诱导电子转移(PET)、分子内电荷转移(ICT)、荧光共振能量转移(FRET)三大类。该探针采用ICT机制构建，荧光探针分子不存在连接基团，荧光核与识别基团通过共价键直接相连，形成给-受电子共轭体系。识别基团与待测物质作用后生成新的基团，影响到共轭体系，改变探针分子内的电荷分布状况，探针分子的能量改变致使其光谱发生改变。通过荧光物质吸收不同波长的激发光由基态被激发到不同能态，然后通过振动驰豫和内部转换(非辐射发射)，而最终达到第一激发单重态的最低振动能级，此时，如果激发态分子发射光量子而回到基态，产生的光辐射即为分子荧光。

新型的BODIPY型荧光探针其结构如图 3所示。

该探针基于ICT机制设计构建，以二氨基马来腈残基作为识别基团，BODIPY荧光染料作为荧光核。为增强该探针的水溶性，在8号位引入了苯甲酸基，以期通过羧基增强探针分子的水溶性。同时为了增强探针的荧光量子产率，在该探针的1号位、7号位引入甲基增加位阻，阻碍8号位芳环的转动。

本实验所用仪器与试剂如表 1与表 2所示。

三口烧瓶中加二氨基马来腈0.221 g，加入20 mL无水乙醇，氮气保护下充分搅拌30 min，在改良后的荧光染料中加入20 mL无水乙醇溶解后转移至三口烧瓶中。组装回流装置，加入0.15 mL冰醋酸，氮气保护下升温至80 ℃，回流反应过夜。过夜后溶液由浅红棕色变为亮紫色，绿色荧光消失。旋蒸除去溶剂，硅胶柱层析分离产品，洗脱剂为二氯甲烷: 甲醇= 10 : 1 (V/V，滴加少量冰乙酸)，除去溶剂后得到紫红色固体，为探针分子，其合成路线如图 4所示。

(1) 次氯酸溶液的配制及标定。

碘量法：在酸性介质中，淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定，至溶液蓝色消失为终点。

步骤：

① 吸取20 mL次氯酸钠溶液置于内装20 mL水并称量的100 mL烧杯中，称量，然后全部转移入500 mL容量瓶中，用水稀释至刻度线，摇匀。

② 吸取试样10.0 mL，置于内装50 mL水的250 mL碘量瓶中，加4 mL盐酸溶液，迅速加入10 mL KI (100 g∙L⁻¹ = 0.6 mol∙L⁻¹)溶液，盖紧瓶塞后加水封，于暗处静置5 min后，用硫代硫酸钠(0.1 mol∙L⁻¹)标准滴定溶液滴定至浅黄色，加入2 mL淀粉溶液(10 g∙L⁻¹)继续滴定，至蓝色消失即为终点。

(2) 活性氧化物、氮化物溶液。

为检测合成探针分子的选择性，共配制0.02 mol∙L⁻¹溶液共4种(H₂O₂、NO、ONOO⁻、CH₃COOOH)。

市售过氧化氢水溶液(30%，9.79 mol∙L⁻¹)，吸取0.2 mL置于100 mL容量瓶中定容；NO使用硝普钠制得，称取硝普钠0.0593 g溶于8 mL PBS溶液中；ONOO⁻需要首先配制碱性过氧化氢溶液，市售过氧化氢溶液4.4 mL稀释至100 mL，冷却至4 ℃后与4 mL氢氧化钠溶液(5 mol∙L⁻¹)混合后稀释至100 mL，加入0.02 mol的亚硝酸异戊酯，稀释10倍；将市售过氧乙酸A、B液混合静置稀释至所需浓度。

(3) 探针溶液的配制。

取探针7.8 mg溶于16.8 mL无水乙醇中，即为浓度1 mmol∙L⁻¹的探针母液，以此作为测试体系。

于5个25 mL的容量瓶中，分别加入10 g∙mL⁻¹的次氯酸标准溶液(使用硫代硫酸钠标定市售次氯酸钠溶液浓，使用时按照标定的浓度稀释至10 mmol∙L⁻¹) 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，以水稀释至刻度，摇匀，此系列标准溶液次氯酸浓度分别为40、80、120、160、200 mg∙L⁻¹。

将200 mg∙mL⁻¹的标准溶液放入试样液池中，打开仪器操作工作站，利用仪器的扫描功能，扫描并记录激发光谱及荧光光谱。确定最佳激发波长λ_ex及最佳荧光波长λ_em。

(1) 取出四个容量为10 mL的具塞比色管，用移液枪分别向每个具塞比色管里加入1 mmol∙L⁻¹的探针溶液0.5 mL，然后再分别向这四个具塞比色管里加入0、1、2、3 mL的次氯酸钠溶液，贴标签，加水定容到10 mL，摇匀。

(2) 用移液枪移取具塞比色管中的溶液到比色管中，比色管中液体体积大约占据比色管的2/3，将比色管放入分光光度计中，利用仪器分析数据，做线性关系图。

(1) 清洗具塞比色管和比色皿，注意比色皿要清洗至没有荧光反应为止，取出一个容量为10 mL的具塞比色管，用移液枪向里面注入0.5 mL 1 mmol∙L⁻¹的探针溶液，和1 mL的自来水，加去离子水定容至10 mL，用移液枪移取具塞比色管里的溶液注入到比色皿中，大约占比色皿体积的2/3，将比色皿放入分光光度仪中测量数据。

(2) 将第一步得到的数据带入到标准曲线中，用来测定自来水中次氯酸钠含量。

利用红外光谱仪，对荧光探针分子进行结构表征。如图 5所示，3411.84 cm⁻¹归属为―OH的特征峰；2579.96 cm⁻¹归属为―C＝C―的特征峰；2929.67 cm⁻¹、2898.81 cm⁻¹归属为―NH₂的特征峰；1645.14 cm⁻¹归属为苯环骨架的特征峰；1452.30 cm⁻¹归属为芳香环的特征峰，初步确定了探针分子的结构。

荧光探针分子由于ICT效应中的特殊情况TICT效应，导致了自身的荧光淬火，无法发出荧光。如图 6探针分子的识别基团二氨基马来腈与次氯酸结合，形成醛基，导致分子内电荷分布情况发生改变，使得探针分子的ICT效应减弱或增强，处于发光状态。

如图 7所示，随着次氯酸浓度不断增加，荧光强度逐渐增强，且峰的位置逐渐向长波方向移动，符合ICT机制。

如图 8所示将等量、等浓度的探针分子与等量不同浓度的次氯酸溶液作用后，在365 nm紫外灯下的现象。次氯酸浓度自左至右依次减小，可看出绿色荧光的强度自左至右逐渐减弱。25 ℃条件下，在pH = 7.4的缓冲体系中，确定探针浓度及次氯酸浓度，向测试体系中加入次氯酸，进行定量的荧光光谱检测，所得结果如图 8所示。

25 ℃条件下，在pH = 7.4的缓冲体系中向探针溶液中加入次氯酸溶液，所得结果如图 9所示。

次氯酸加入测试体系之后荧光强度迅速增强，在2 s内即达到最大荧光强度。动力学曲线表明合成的荧光探针分子响应迅速，能与次氯酸以极快的速度充分反应。

25 ℃条件下，在pH = 7.4的缓冲体系中向探针溶液中加入0.02 mol∙L⁻¹的测试选择性液，共4种(H₂O₂、NO、ONOO⁻、CH₃COOOH)。检测结果如图 10所示。

如图 10所示，探针与其他氧化剂反应后其荧光强度与探针空白样品无明显变化，而探针分子与次氯酸作用后荧光强度明显增强，说明该探针对次氯酸有着较好的选择性，能够较好地区分检测次氯酸。

如图 11所示，探针分子与不同浓度的次氯酸作用后的荧光强度呈上升趋势，荧光强度达到最大时次氯酸浓度为2.5 × 10⁻⁴ mol∙L⁻¹。探针分子在0–2.5 × 10⁻⁴ mol∙L⁻¹的次氯酸浓度范围中，荧光强度与次氯酸浓度的线性关系为Y = 2.6847X + 3.13922 (R² = 0.997)，说明荧光探针分子在一定次氯酸浓度范围内荧光强度与次氯酸浓度具有良好的线性关系。并测定自来水样品中的ClO⁻浓度约为0.54 μmol∙L⁻¹。向自来水样品中加入一定标准浓度NaClO溶液，一系列浓度分别为0.40、0.80和1.2 μmol∙L⁻¹，仍然可得到满意结果，回收率均在90%以上，表明了结果的可靠性和准确性。

实验总学时为12学时，分3次完成。具体安排如下：第一次，4学时，讲解实验内容与安排，讲解实验原理，讲解数据处理与数据测定，精密度与准确度的要求，合成探针分子；第二次，分离产品，得到探针分子，配制检测所用溶液，准备实验材料等；第三次，4学时，进行标准曲线的测定、标准曲线的绘制和自来水中次氯酸含量的测定。

本实验是在近年科研课题“BODIPY荧光染料及荧光探针研究”研究过程中，发现、设计转化成的综合化学实验。实验所得探针具有可视化表征，易于激发学生的实验兴趣。通过优化分子结构从而影响其荧光探针性质，克服BODIPY (氟硼二吡咯)类荧光染料发射波长较短、亲水性较差的缺点，更有助于加深学生对荧光探针发光原理、探针结构与荧光性质之间关系的理解。在实验创新性上，本实验科教融合，将科学研究前沿和热点的荧光检测技术引入教学实践，更能拓展背景知识，激发学生的实验兴趣。还可以锻炼基础，综合性强；训练有机合成、仪器表征等实验的技能。

在合成方面，本实验操作性强，探针易合成、产率高，制备方法简单，产品易纯化，适合作为学生实验。在实验内容方面，本实验包括了有机合成、仪器分析、荧光性质表征三部分，涵盖知识点丰富，综合性强。在教学组织方面，本实验可作为高年级综合实验开设，培养学生的科学思维、理论与实践相结合的能力。