理性改造光脱羧酶并用于反式脂肪酸选择性脱羧反应

doi:10.3866/PKU.DXHX202210002

大学化学 >> 2023, Vol. 38 >> Issue (4): 243-252.doi: 10.3866/PKU.DXHX202210002

所属专题：第3届全国大学生化学实验创新设计竞赛

理性改造光脱羧酶并用于反式脂肪酸选择性脱羧反应

曾森海, 鲍雨妍, 曹奡, 黄小强()

配位化学国家重点实验室, 南京大学化学与生物医药创新研究院, 南京大学化学化工学院, 南京 210023

收稿日期:2022-10-04 录用日期:2022-12-11 发布日期:2023-04-27
通讯作者: 黄小强 E-mail:huangx513@nju.edu.cn

Rational Evolution of a Fatty Acid Photodecarboxylase for Highly Selective Photodecarboxylation of trans Fatty Acid

Senhai Zeng, Yuyan Bao, Ao Cao, Xiaoqiang Huang()

State Key Laboratory of Coordination Chemistry, Chemistry and Biomedicine Innovation Center, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing 210023, China

Received:2022-10-04 Accepted:2022-12-11 Published:2023-04-27
Contact: Xiaoqiang Huang E-mail:huangx513@nju.edu.cn

摘要/Abstract

摘要：

立足光酶催化合成和酶的理性改造等研究前沿，设计了一例光酶催化的反式脂肪酸高选择性脱羧去除实验。具体地，本实验借助分子对接技术，理性设计脂肪酸光脱羧酶CvFAP的突变体V453E-CvFAP，并实验验证该突变体能够选择性地催化反油酸的脱羧反应，从而实现顺式脂肪酸的富集。实验涉及培养细胞、诱导酶表达、提取酶液、设计反应以及产物的定性、定量分析等内容，非常适合在化学生物学实验或综合化学实验课程中开设。

关键词: 酶的理性改造, 脂肪酸光脱羧酶CvFAP, 反式脂肪酸, 光酶催化, 脱羧反应

Abstract:

Photoenzymatic synthesis and rational engineering of enzymes are among the most emerging research areas. Herein, a highly selective photodecarboxylation of trans fatty acid was achieved by rational repurposing of the photodecarboxylase. Specifically, via molecular docking, a mutant of the photodecarboxylase CvFAP, namely V453E-CvFAP, was rationaly designed, constructed and subjected to the photoactivated decarboxylation of fatty acids. It turned out that the mutant was highly selective towards elaidic acid, thereby enriching oleic acid. Experimental trainings like cells culturing, protein expression, reaction design, and qualitative and quantitative analysis of products were included. The experiment is easy to conduct and safe for undergraduate chemistry experiment.

Key words: Rational evolution of enzyme, Photodecarboxylase CvFAP, Trans fatty acid, Photobiocatalysis, Decarboxylation

曾森海, 鲍雨妍, 曹奡, 黄小强. 理性改造光脱羧酶并用于反式脂肪酸选择性脱羧反应[J]. 大学化学, 2023, 38(4): 243-252.

Senhai Zeng, Yuyan Bao, Ao Cao, Xiaoqiang Huang. Rational Evolution of a Fatty Acid Photodecarboxylase for Highly Selective Photodecarboxylation of trans Fatty Acid[J]. University Chemistry, 2023, 38(4): 243-252.

链接本文: https://www.dxhx.pku.edu.cn/CN/10.3866/PKU.DXHX202210002

https://www.dxhx.pku.edu.cn/CN/Y2023/V38/I4/243

图/表 14

图1

表1

图2

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参考文献 14

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课时	实验内容
第一次课 8 h	1) 接种WT–CvFAP、V453E–CvFAP菌种、扩大培养、诱导表达； 2) 使用AutoDock分子对接，理解突变位点的选择； 3) 菌体收集
第二次课 8 h	1) 获得粗酶溶液； 2) 用FAD辅基定量分析酶浓度； 3) 光酶反应，并使用GC-MS进行表征
第三次课 8 h	1) 绘制底物标准曲线，计算转化率； 2) 自主探索实验条件对结果的影响； 3) 对实验结果和分子对接结果分析讨论

组别	m(油酸)/mg	m(反油酸)/mg	V(MeOH)/mL	酶液
第一组	10.11	0	1.00	WT-CvFAP
第二组	0	9.97	1.00	WT-CvFAP
第三组	10.11	0	1.00	V453E-CvFAP
第四组	0	9.97	1.00	V453E-CvFAP

底物	酶	d ^*/Å
油酸	野生型	5.3
反油酸	野生型	5.2
油酸	突变体	5.1
反油酸	突变体	4.5

酶液	A ^b	A₀ ^c	A − A₀	c(FAD)/(mmol∙L⁻¹)	c(粗酶)/(mmol∙L⁻¹)
WT-CvFAP	0.742	0.647	0.095	0.0201	0.100
V453E-CvFAP	0.764	0.647	0.117	0.0247	0.124

酶液	c(酶) ^a/(μmol∙L⁻¹)	底物	c(底物) ^a/(mmol∙L⁻¹)	α ^b/%	TON ^c
V453E-CvFAP	30.0	反油酸	3.53	100	118
V453E-CvFAP	30.0	油酸	3.58	78.1	93
V453E-CvFAP	22.5	反油酸	3.53	100	157
V453E-CvFAP	22.5	油酸	3.58	50.2	80
V453E-CvFAP	10.0	反油酸	3.53	100	353
V453E-CvFAP	10.0	油酸	3.58	12.1	43
V453E-CvFAP	5.00	反油酸	3.53	97.3	697
V453E-CvFAP	5.00	油酸	3.58	3.40	26
V453E-CvFAP	2.00	反油酸	3.53	28.7	505
V453E-CvFAP	2.00	油酸	3.58	0.3	6.3
WT-CvFAP	5.00	反油酸	3.53	100	706
WT-CvFAP	5.00	油酸	3.58	100	716

理性改造光脱羧酶并用于反式脂肪酸选择性脱羧反应

Rational Evolution of a Fatty Acid Photodecarboxylase for Highly Selective Photodecarboxylation of trans Fatty Acid

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酶液	c(酶)/(μmol∙L⁻¹)	底物	c(底物)/(mmol∙L⁻¹)	α/%	TON
WT-CvFAP	5.00	反油酸	3.53	100	706
WT-CvFAP	5.00	油酸	3.58	100	716
V453E-CvFAP	5.00	反油酸	3.53	97.3	697
V453E-CvFAP	5.00	油酸	3.58	3.40	26