国家大学生创新性实验计划是高等学校本科教学“质量工程”的重要组成部分，旨在探索并建立以问题和课题为核心的教学模式，倡导以本科学生为主体的创新性实验改革，调动学生的主动性、积极性和创造性，激发学生的创新思维和创新意识，全面提升学生的创新实验能力^{[1, 2]}。华南理工大学制药工程专业开设了专业综合实验，目的是提高学生综合运用已学知识和技能的能力，培养学生的创新意识，使之成为国家和企业需要的新型制药工程师。该专业是化学、药学(中药学)和工程学相交叉的工科类专业。因此我们根据学科要求和专业特点设计综合实验，从槐花米中提取芦丁是基础化学实验中经典的实验^[3]，主要目的是掌握酸碱法提取黄酮苷类的原理和方法，并掌握化学鉴别实验的应用。复方芦丁一贯作为高血压的辅助治疗药物，因此制药工程专业常常会在综合实验中开设该实验，我们曾将其改造为“芦丁的提取鉴定和胶囊的制备”。通过教学实践，我们认为学生修完了无机化学、有机化学、分析化学、仪器分析、药物化学、药物合成反应、制药工艺学、制药工程学、制药工程设备等基础课程和专业课程，已具有了一定的学科积累和实验技能，以前的设计仍然不是一个完整的工艺流程。为了使学生更好地体验药企的研发和生产实践全过程，我们引进“以问题为基础的学习” (problem based learning，简称PBL)研究性教学方法探索制药工程专业综合实验课程改革，将该实验设计为“芦丁的提取鉴定及不同剂型与体内释放相关性的研究”。

PBL研究性教学法的关键是教师要以学生为中心，根据教学目的和学生的具体情况精心设计出具有高度科学性、合理性、开放性和可行性的问题。让学生由被动学习转变为主动学习。这一教学方法已经成为发达国家推崇的教学改革的方法^{[4, 5]}，并且在制药工程专业实验中也多有探索性应用^[6-8]。基于此，我们将综合实验设计为如图1所示的三个相关联的模块，设定选题后，每个模块都具有开放性，学生可以通过查阅资料和讨论，确定各自的实验方案。例如本实验中，学生在讲义提供的提取方案外至少设计一种提取方法，采用至少两种方法提取芦丁；完成原料药的制备和工艺路线的优化和性质检测，并对比不同提取方法的效果；各组选择不同的胶囊、片剂、滴丸剂等成药剂型，并据此设计处方组成；根据不同的成品制剂进行相应的质量监控；之后进行数据处理和撰写实验报告。通过2011、2012、2013级三届制药工程专业共计96名学生的实践和反馈表明，整个过程使得学生认识完整的制药工艺流程，提高对多门课程知识的综合运用和解决问题的能力，增强创新意识，对提高本科生人才质量具有重要意义。本文旨在通过一个完整的实验表达综合创新实验的设计思路。

槐花米作为一种常用的中药，具有清肝泻火，治疗肝热目赤、头痛眩晕的功效，可用作止血药。其主要含有黄酮类成分，其中芦丁的含量高达12%-20%，另含有少量皂苷。芦丁也称作芸香苷，是淡黄色针状结晶，分子式为C₂₇H₃₀O₁₆∙3H₂O，熔点174-178 ℃。1 g芦丁可溶于7 mL甲醇、8000 mL冷水、200 mL沸水；溶于吡啶、甲酰胺和碱液，微溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿、二硫化碳、乙醚、苯和石油醚。芦丁的黄酮部分连有许多酚羟基，故易溶于碱液，酸化析出，这是本实验采用酸碱调节法来提取芦丁的依据。同时利用它在冷水和热水中的溶解度相差较大的特性进行重结晶提纯。天然的黄酮类化合物及其苷类化合物的鉴定常采用双向色谱法。因此芦丁的分离鉴定可以用纸色谱进行。同时也用显色反应进行鉴定。

胶囊剂是指将药物盛装于硬质空胶囊或具有弹性的软质胶囊中支撑的固体制剂。本次实验制备硬胶囊，将一定量的药物和辅料制成均匀的粉末或颗粒，充填于空胶囊中。胶囊的质量控制主要有外观、装量差异、崩解度和溶出度。片剂是指药物与辅料均匀混合后，用压片机压成圆片状或异形片状的分剂量的固体制剂。片剂的质量控制主要有外观形状、片重差异、硬度或脆碎度、崩解时限、溶出度或释放度、含量均匀度和微生物等。

采用不同pH的溶液模拟体内不同的体液，通过崩解度研究其在体内释放的相关性。

教学过程的安排大体如表1所示。本实验内容涉及文献调研、原理讨论、原料准备、方案预研、原料药和成品药的制备、性能表征、撰写报告、成果展示等。

芦丁的提取有多种方法、其制剂也有多种并涉及多项不同的表征方法。为了达到实验的基本目的，本课程中提供了基本的实验方案。本文仅介绍经典的碱提酸沉法提取和纯化芦丁，以及复方芦丁胶囊的制备和质量监控等相关内容以及一套完整的实验结果数据，并通过对实验限项和结果的分析讨论介绍实验设计的机理。

原料：槐花米(大森林药店购买)；芦丁标准品(芸香叶苷∙三水≥ 98%)，硼砂、氢氧化钙、盐酸；浓硫酸、乙醇、α-萘酚、镁粉、无水甲醇、三氯化铝、乙醚、丙酮、正丁醇、冰醋酸；维生素C、淀粉、滑石粉；磷酸二氢钾、氢氧化钠；空胶囊。除特别注明外，其他试剂均为分析纯，所有材料均通过广州市芊荟化玻有限公司购置。

仪器：试管(10 mm × 75 mm)、移液管(10 mL)、容量瓶(50 mL)、烧杯(800 mL)、量筒(5 mL，250 mL)、研钵(13 cm)、集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S，巩义市予华仪器有限责任公司)、旋转蒸发仪(RE-52AA，上海亚荣仪器有限公司)、中药粉碎机(DFT-250，北京永光明医疗器械仪器厂)、减压过滤装置，手提式紫外灯(WFH-204B，深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司)、层析缸(8 cm × 30 cm)、硬胶囊板(WK-14-209，青州市迈德森制药机械厂)、分析天平(AL-104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、四用药物溶出仪(RC-6D，天津新天光分析公司)、紫外分光光度计(UV-2800，优尼克(上海)仪器有限公司)、熔点仪(Optimelt，美国Stanford公司)、色谱用滤纸(中速，15 cm × 6 cm)、pH试纸。

取槐花米粗粉30 g (压碎)，置于800 mL烧杯中，加0.4%硼砂水沸腾溶液200 mL。在搅拌下以石灰乳(氢氧化钙的饱和溶液)调至pH = 8-9，加热微沸30 min，补充失去的水分，并保持pH = 8-9，倾出上清液，用4层纱布过滤，重复提取一次。合并滤液，将滤液用6 mol∙L^-1盐酸调至pH = 5左右，放置于冰箱中析晶。抽滤，用蒸馏水洗3-4次，放置于空气中自然干燥得粗品芦丁，称重。取粗品芦丁，用适量沸水溶解，趁热抽滤，放置冷却后析出晶体，抽滤得芦丁精制品。

(1)处方组成：芦丁2.0 g，维生素C 1.0 g，淀粉17.0 g，滑石粉适量(1.0 g)。

(2)制法：将主药芦丁提取物研磨成粉末状，过80目筛，按处方称取各原料，混合均匀即可。

(3)硬胶囊的填充：用胶囊板制备胶囊。

(1)芦丁熔点和含量的测定：用熔点仪测定标准品及精制品的熔点；用紫外分光光度计测定芦丁的标准曲线和含量。

(2)芦丁的性质实验：取芦丁10 mg，用5 mL乙醇溶解，即为样品溶液。分别进行三氯化铝纸片反应、Molish反应、盐酸镁粉反应和纸色谱检验。

(3)胶囊的质量检查：用肉眼进行外观检查；用分析天平进行装量差异测量；用四用药物溶出仪测定崩解度。

在提取时应注意将槐花米用中药粉碎机粉碎，使芸香苷易于在热水中溶出。槐花米中含有大量粘液质，加入石灰乳使之生成钙盐沉淀除去。pH应严格控制在8-9，不得超过10。因为在强碱条件下煮沸，时间稍长可促使芸香苷水解而破坏，使得收率下降，一般以30 min左右为宜。一般认为酸沉淀时pH应为4-5，不宜过低，否则会使芸香苷形成烊盐溶于水或水解为槲皮素，也降低收率。但也有研究结果表明pH = 9.0碱提，配合pH = 2.0酸沉淀，得到最大产率21.9%^[9]。提取过程中加入硼砂作为缓冲剂，既能调节碱性水溶液的pH，又能保护芸香苷分子中的邻二酚羟基不被氧化，亦保护不与钙离子络合，使芸香苷不受损失。

本实验的平均粗品芦丁产率为18.62%，提纯后芦丁精制品产率为10.61%。芦丁精制品的熔点为175.7-178.0 ℃。

取芦丁对照品10 mg，精密称定，定容至50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即为0.2000 mg∙mL^-1的储备液。用移液管分别量取2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00 mL至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，以溶剂为空白，在360 nm处测定吸光度A。以吸光度A为纵坐标，以浓度c为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及回归系数。另取自制的芦丁样品10 mg，按上述方法配制0.2000 mg∙mL^-1的原溶液，用移液管量取5.00 mL样品原溶液至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以溶剂为空白，测定360 nm处的吸光度，带入标准曲线求得芦丁含量。如图2所示为芦丁标准曲线，回归方程为：y = 25.063x + 0.028，R² = 0.9923，据此可求得吸光度为0.497，得芦丁溶液浓度为0.0187 mg∙mL^-1，则芦丁的质量为9.36 mg，即芦丁的含量为93.6%。

①三氯化铝纸反应：在一张滤纸上滴加样品溶液后，加1% AlCl₃乙醇溶液2滴，样品在紫外灯254 nm和365 nm下都有荧光圈出现，如图3(a)所示。这是因为黄酮类化合物分子中常含有下列结构单元：

故常可与铝盐、铁盐、锆盐、镁盐等试剂反应，生成有色络合物。

②盐酸-镁粉反应：取样品溶液少量于试管中，加入金属镁粉少许，盐酸2-3滴，观察并记录颜色变化。加入镁粉后，产生大量粉红色气泡，溶液由淡黄色变为红色，如图3(b)所示。该反应的机制过去解释为由于生成了花色苷元所致，现在认为是因为生成了阳碳离子的缘故。证明样品为黄酮类的芦丁。

③ Molish反应：取样品溶液1 mL加10% α-萘酚溶液1 mL (α-萘酚用95%乙醇溶解)，振荡后斜置试管，沿管壁滴加浓硫酸，静置。滴加硫酸后，液面出现分层，上层为清液，下层为黄色清液，随着浓硫酸的滴加，液面交界处出现紫红色的环，如图3(c)所示。这是因为糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，用以鉴定单糖的存在。本实验证明样品为芦丁，因为它是糖苷，而槲皮素是苷元，不发生Molish反应。

④纸色谱检验：芦丁精制品样品溶液和芦丁标准品的乙醇溶液作为展开试样。展开剂体积比为正丁醇:冰醋酸:水= 4 : 1 : 5上层溶液，配制200 mL展开剂后预饱和15 min。在层析1号滤纸(15 cm × 6 cm)上点样，采用上行展开方式。展开后，取出，在太阳光下和紫外365 nm下观察层析试纸。喷w = 95%的AlCl₃作为显色剂，在烘箱中平放干燥，置于日光和紫外灯(365 nm)下观察色斑的变化，如图4所示，可见喷显色剂后，在紫外灯下可看到亮绿色斑点，且与芦丁标准品移动距离相同，表明所制得的样品为芦丁。根据色谱图计算比移值R_f = 6.02/11.52 = 0.522。

按处方制备的胶囊如图5(a)所示，胶囊外观整洁，无黏结、变形或破裂现象，无异味，符合胶囊外观检查的要求。

胶囊装量差异性测量，取供试品分别精确称量其质量差异，再倾出内容物，称量囊壳重量。装量差异性标准要求平均装量0.30 g以下，装量差异限度为±10%；0.30 g或0.30 g以上，装量差异限度应为±7.5%，并不超出限度1倍。装量结果见表2，平均装量为0.4850 g，所以装量差异限度应为±7.5%，即限度为0.4486 g至0.5214 g，由数据看出，只有7号胶囊的装量差异为8.7% (>7.5%)，不符合限度要求，但并没有超出限度1倍，因此，胶囊总体符合装量差异的检查。

崩解度的实验结果如图5(b)-5(d)所示，分别在蒸馏水、pH = 6.8的缓冲溶液及0.1 mol∙L^-1盐酸中，设置溶出仪转速为100 r∙min^-1，温度为37.5 ℃。结果表明胶囊在三种溶液中都于30 min内崩解完毕，符合崩解度要求。

作为一个开放度极高的综合实验，本文仅提供了一种较为经典的做法。事实上，本实验的每个环节都有很多可以拓展的内容。首先，可以根据《中国药典》中的标准方法测定槐米中芦丁的含量^[10]，以便准确测定芦丁的提取率。芦丁的提取和提纯有多种方法可选^{[11, 12]}，如实践中学生也设计了碱溶酸沉淀法、水提取法(即煎煮法)、醇提取法、超声波提取法等不同的提取方法，获得了不同的产率。也有研究表明，用亚硫酸钠作为抗氧化剂可以提高芦丁的产率^[13]。水重结晶法、醇结晶法和醇-水结晶法都是学生实验中选用的方法。提取率是个重要指标，因此通过单因素法或正交法优化提取工艺也具有重要意义^[14]。也可以在检测项目中拓展出不同阶段的产品的紫外光谱、红外光谱、气相色谱等项目；可以同时用槲皮素作为对照，检验提取物是否生成了槲皮素，探究如何优化制备工艺以减少槲皮素的产生。芦丁的来源广泛^[15]，苦荞^[16]甚至玉米须^[17]中都可以提取芦丁，因此实验中可以因地制宜地选取不同的起始材料。

近几年的探索和实践证明，综合实验有利于激励学生的求知愿望，有利于学生理论联系实际，有利于提高学生的实验技能和科研意识。本文所设计的综合实验结合了有机化学、分析化学、药物化学、药物合成、制药设备等专业的基本理论知识；形成了完整的原料药制备、药物剂型制备及质量监控等环节；完成了药物制备、性能检测、数据整理和分析、撰写报告等程序。通过“实验准备、实验实施、实验总结”三个环节的渐进式训练，学生经历了挫折的考验、体会了成功解决问题的喜悦，完成了药企研发实训过程，有利于培养和提高学生融会贯通、举一反三、独立思考、勇于创新等能力。