铬黑T是大学化学实验常用的重要金属指示剂，可以与金属离子络合，形成与指示剂本身颜色不同的络合物，从而指示溶液中金属离子浓度的变化^[1–3]。铬黑T的分子式为C₂₀H₁₂N₃NaO₇S (1-(1-羟基-2-萘基偶氮)-6-硝基-2-萘酚-4-磺酸钠盐)，是一种有机弱酸盐，在水溶液中存在三级解离。常用的解离常数测定方法主要有电势滴定法^{[4, 5]}、电导法^{[6, 7]}、毛细管电泳法^[8]、色谱法^[9]、红外光谱法^[10]、荧光光谱法^[11]、紫外-可见分光光度法^{[12, 13]}等。紫外-可见分光光度法适用于具有紫外-可见吸收特性的物质，实验方案简单高效。实验测定不同pH铬黑T溶液的紫外-可见吸收光谱，通过光谱特征分析，分段拟合pH与lg((A₀ − A₁)/(A₁ − A₂))的线性关系，从而计算得出铬黑T的解离常数pK_a1、pK_a2、pK_a3。

紫外-可见光谱仪(日本岛津SHIMADZU，UV-2450)，电子天平(德国赛多利斯，BSA124S，±0.0001 g)，电子天平(YP6001，±0.1 g)，酸度计(上海雷磁仪器厂，pHS-3C)，移液枪(Thermo Lab Serv Junior，1–5 mL、100–1000 μL、10–100 μL)，容量瓶(北京欣维尔，50.00 mL、250.00 mL)。

HCl、NaOH、NaH₂PO₄·2H₂O、K₂HPO₄·3H₂O、KCl、分析纯级(国药集团)；铬黑T (天津市北辰方正试剂厂)。

(1) 铬黑T母液：准确称取0.1250 g铬黑T，用去离子水溶解，并定容于250.00 mL容量瓶，配成母液浓度1.084 × 10⁻³ mol·L⁻¹。

(2) 缓冲溶液：配制pH 4.00、6.86和9.18的标准缓冲溶液，各250 mL。

(3) 其他溶液：配制0.1 mol·L⁻¹ HCl，0.01 mol·L⁻¹及1 mol·L⁻¹ NaOH，0.2 mol·L⁻¹ NaH₂PO₄，0.1 mol·L⁻¹ K₂HPO₄，1 mol·L⁻¹ KCl溶液，各100 mL。

(4) 铬黑T溶液：取29个50.00 mL的容量瓶，分别准确移取铬黑T母液4.00 mL；按不同的组合和添加量，分别加入0.1 mol·L⁻¹ HCl、0.01 mol·L⁻¹ NaOH、1 mol·L⁻¹ NaOH、0.2 mol·L⁻¹ NaH₂PO₄或0.1 mol·L⁻¹ K₂HPO₄，调节每个溶液的pH；用KCl溶液调节离子强度；用去离子水定容到50.00 mL，配制成pH为2.09–12.98的系列溶液。

在不同pH下，铬黑T溶液存在三级解离，解离过程见图 1。

铬黑T溶液具有紫外-可见吸收特性，一级、二级、三级解离的紫外-可见吸收光谱差异较大。在酸度较高的溶液中，铬黑T以三元弱酸形式存在，结构中含有一个磺酸基和二个羟基。

每级解离方程均可简化为：

$ \mathrm{HD} \rightleftarrows \mathrm{H}^{+}+\mathrm{D}^{-} $

当达到解离平衡时：

(1)$ \mathrm{p} K_{\mathrm{a}}=\mathrm{pH}-\lg \frac{[\mathrm{D}]^{-}}{[\mathrm{HD}]}$

其中：K_a表示解离常数，[D]⁻、[HD]表示达到解离平衡时各自的浓度。

在酸度较高时，溶液中弱酸主要以HD形式存在，此时的吸光度设为A₀；在碱度较高的溶液中，弱酸几乎完全解离为D⁻，此时吸光度设为A₂；pH介于二者之间时，溶液中HD和D⁻共存，吸光度设为A₁。根据Lambert-Beer定律^[14]，将公式(1)变换推导^[1]可得：

(2)$ \mathrm{pH}=\mathrm{p} K_{\mathrm{a}}+\lg \left(\frac{A_0-A_1}{A_1-A_2}\right)$

将配制的pH为2.09–12.98的29个铬黑T溶液样品(样品编号1–29)，用紫外-可见分光光度计测定其吸收光谱，计算得到与pH对应的lg((A₀ − A₁)/(A₁ − A₂))系列数据，经回归拟合得出解离常数pK_a。

以标准缓冲溶液(pH 4.00，6.86，9.18)为参比，用pHS-3C酸度计测定配制的29个铬黑T溶液样品的pH，见表 1。

首先，在1 cm石英比色皿中以去离子水为参比，在波长400–800 nm间扫描用于调节溶液pH的HCl、NaOH、NaH₂PO₄、K₂HPO₄和调节离子强度的KCl溶液，结果显示，这些溶液在扫描范围内均无吸收，不会对铬黑T溶液样品造成光谱干扰。然后，在同样条件下扫描29个铬黑T样品，得到紫外-可见吸收光谱，见图 2(a–c)。

由图 2可见，随着溶液pH的升高，紫外-可见吸收光谱的最大吸收峰先从516 nm红移到618 nm，之后再蓝移至455 nm，溶液的颜色从紫红到蓝色再到橙色，表明铬黑T在不同的pH条件下，其解离程度不同。随着pH升高，铬黑T逐级解离，每级解离的吸收光谱差异较大，因此可以用紫外-可见分光光度法测定铬黑T的各级解离常数。

根据图 2(a)，pH 2.09和2.82的紫外-可见吸收曲线基本重合，最大吸收峰位于516 nm处，此时样品中铬黑T以分子型存在，用H₃D表示。随着pH的升高，吸光度缓慢增加，铬黑T发生一级解离，pH 4.77和4.98的吸收曲线基本重合，至此，一级解离基本结束，此时铬黑T主要以H₂D⁻型存在。在pH 2.82–4.77间，解离程度不同，H₃D和H₂D⁻共存。

图 2(b)表明，当pH > 4.98时，随着pH的升高，最大吸收峰位渐渐红移至618 nm处，吸光度迅速提高，铬黑T发生了二级解离。当pH为8.63时吸光度达到最大，与pH 8.97的吸收曲线重合，二级解离基本结束，此时铬黑T以HD²⁻型存在。在pH 4.98–8.63间，H₂D⁻和HD²⁻共存。

图 2(c)显示，当pH > 8.97时，随着pH的升高，618 nm处的吸光度开始减小，吸收曲线发生了显著的变化，最大吸收峰从618 nm逐渐蓝移至455 nm处，455 nm处的吸光度逐渐增加，铬黑T发生了三级解离。由于pH > 13后的溶液不易调节，且pH > 12.81后的曲线变化校小，可以认为pH 12.98时，铬黑T基本完全解离，以D³⁻型存在。在pH 8.97–12.98间，HD²⁻和D³⁻共存。

以618 nm处吸光度为例来分析计算。根据前述分析，pH为2.09时，铬黑T以分子型存在，设此时的吸光度0.103为A₀；pH为4.77时，一级解离基本完成，设此时的吸光度0.112为A₂；pH为2.82、3.18、3.55、3.90、4.22、4.50时，吸光度为A₁，由此可以计算一级解离的lg((A₀ − A₁)/(A₁ − A₂))系列值。pH为4.98时，开始二级解离，设此时的吸光度0.112为A₀，pH为8.63时，二级解离基本完成，设此时的吸光度0.893为A₂；pH为5.54、5.75、5.98、6.25、6.74、7.02、7.85时，吸光度为A₁，由此可以计算二级解离的lg((A₀ − A₁)/(A₁ − A₂))系列值。pH为8.97时，开始三级解离，设此时的吸光度0.894为A₀，pH为12.98时，三级解离基本完成，设此时的吸光度0.098为A₂；pH为10.16、10.42、10.84、11.26、11.58、11.76、11.98、12.27、12.58、12.81时，吸光度为A₁，由此可以计算三级解离的lg((A₀ − A₁)/(A₁ − A₂))系列值。计算结果详见表 2。

同理，以516 nm和455 nm处吸光度来分析计算各级解离的lg((A₀ − A₁)/(A₁ − A₂))系列值，结果详见表 3、表 4。

根据pH和相应的lg((A₀ − A₁)/(A₁ − A₂))，用ORIGIN进行拟合。以516 nm处一级解离为例，将pH 3.18、3.55、3.90、4.22、4.50与相应的lg((A₀ − A₁)/(A₁ − A₂))系列值−1.040、−0.300、0.000、0.477、1.041进行回归分析，得到拟合方程为：

$y=0.661 x+3.85 $

其中：x为$\lg \left( {\frac{{{A_0} - {A_1}}}{{{A_1} - {A_2}}}} \right) $，y为pH。

拟合曲线见图 3。

同理，516 nm、618 nm、455 nm等处其他拟合曲线见图 4–图 8。

拟合方程在y轴上的截距即为pK_a值，由此得出，铬黑T的解离常数pK_a1为3.85 (516 nm)和3.94 (618 nm)，pK_a2为6.35 (516 nm)和6.41 (618 nm)，pK_a3为11.57 (455 nm)和11.43 (618 nm)。计算结果详见表 5。

所有拟合方程可决系数R²均大于或等于0.966，表明pH与相应的lg((A₀ − A₁)/(A₁ − A₂))有较强的线性关系，方程拟合度均较好。

拟合计算得到的pK_a值和相关文献值^{[1, 15]}的相对偏差在−1.38% – 1.13%之间，详见表 6，说明实验测定结果的准确度较高。

为确定在不同波长处测定的pK_a值是否存在显著性差异，采用F检验法，对数据进行检验。以pK_a1为例，根据化学数据速查手册^[16]，S_大 = 0.0518 (n = 6)，S_小 = 0.0342 (n = 5)，查表可知，在置信度为95%时，F_{表(5, 4)}为6.26。

$ F_{\text {计算 }}=\frac{S_{\text {大 }}^2}{S_{\text {小 }}^2}=\frac{0.0518^2}{0.0342^2}=2.29$

F_计算 < F_表，说明在516 nm和618 nm处测定的pK_a1值无显著性差异。

同样对在不同波长处测定的pK_a2和pK_a3也进行了F检验，F_计算均小于F_表，详见表 6。

由此可见，通过紫外-可见分光光度法在不同波长处测定的解离常数无显著性差异，准确度较高。

利用铬黑T溶液的光谱特性，通过配制一系列不同pH的铬黑T溶液，测定在不同解离程度下紫外-可见吸收光谱的吸光度，用ORIGIN软件进行拟合，推导出相应的数学模型，计算铬黑T水溶液的解离常数pK_a1、pK_a2、pK_a3。实验表明，用紫外分光光度法测定铬黑T解离常数是可行的，且实验时无需配制准确浓度的铬黑T，仅要求每份溶液的浓度相等，实验方案简单，不同波长处测定的三级解离常数偏差小、一致性好、准确度高。具体教学实践中，可以将学生分为三组，同时分别测定pK_a1、pK_a2、pK_a3，引导学生对结果进行分析讨论。用紫外分光光度法测定铬黑T解离常数，可以拓展、延伸大学本科化学实验教学内容，帮助学生深刻认识铬黑T特性和使用条件，理解酸碱多级解离过程，掌握分光光度法测定解离常数的基本原理，熟悉用ORIGIN处理实验数据、建立数学模型，培养学生综合分析和解决问题的能力。