“菠菜叶中色素的提取与分离”是大学有机化学实验课程及中学实验教学中的经典项目之一。菠菜叶中不同色素呈现不同颜色，可以形象、生动地展示色素分离过程，在帮助学生认识天然化合物、理解色谱分离基本原理^[1]、掌握薄层色谱和柱色谱等基本实验操作技能、激发学生的实验兴趣^[2]等方面发挥了重要作用。

自从1985年叶绿素的提取及分离实验出现在教学课本之后^[3]，教育工作者对该实验进行了大量的优化改进^[4–13]。该实验也先后被收录到大学本科的有机化学实验教材中，如汪志勇等人主编的《实用有机化学实验高级教程》、查正根等人主编的《有机化学实验》、侯士聪等人主编的《基础有机化学实验》等^[14–23]。但是，其实际教学效果仍然不尽如人意，特别是在4–6学时的基础实验课程教学中，仍然存在着大量使用甲醇、苯等毒性较大的试剂^[4–13]、实验步骤繁琐^[12]、用时较长、试剂用量大^[13]、分离效果不佳^{[4, 8]}等问题。

为进一步解决本实验在实际教学中暴露出的问题，提高该实验的实际教学效果，本文系统总结了目前已提出的色素分离方法，对比分析了实际色素分离效果，通过优化薄层色谱展开剂、改进柱色谱流动相组成，制定了耗时更短、试剂更友好、分离效果更理想的菠菜叶色素提取与分离实验方案。

菠菜中含有叶绿素、叶黄素和胡萝卜素等多种天然色素。叶绿素主要存在叶绿素a (C₅₅H₇₂N₄O₅Mg)和叶绿素b (C₅₅H₇₀O₆N₄Mg)两种结构相似的形式。胡萝卜素(C₄₀H₅₆)是一类长链多烯类的化合物。叶黄素(C₄₀H₅₆O₂)是胡萝卜素的衍生物。图 1为各色素的分子结构示意图。色素各组成存在明显的极性差异，极性从小到大依次为胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素。

本实验从菠菜叶中提取色素，利用各色素的极性差异，通过薄层色谱法和柱色谱法进行分离、鉴定和提纯。薄层色谱实验中，因各色素的极性差异，层析板上的硅胶对各色素组分的吸附能力不同，当展开剂流过硅胶板时，不同色素连续发生吸附、解吸附过程，最终实现各色素组分互相分离。柱色谱也是分离、提纯有机物的重要方法，本实验利用吸附柱色谱通过连续地吸附、解吸附过程，实现色素各组分的分离、提纯。

正己烷(分析纯)，丙酮(分析纯)，正丁醇(分析纯)，无水乙醇(分析纯)，10%氯化钠溶液(质量分数)，无水硫酸钠(分析纯)，硅胶(100–200目)，中性氧化铝(100–200目)，石英砂(分析纯)，新鲜菠菜。

层析柱(内径14 mm，长300 mm)，100 mL锥形瓶，60 mL梨形分液漏斗，胶头漏斗，玻璃棒，滴管，脱脂棉，200 mL烧杯，10 mL量筒，50 mL量筒，天平，铁架台，层析缸，毛细管，薄层色谱板(25 mm × 75 mm)。

在研钵中放入2.0 g新鲜菠菜叶(剪碎)，研磨。加入22.0 mL丙酮和3.0 mL正己烷，搅拌、研磨至叶片变白^[24]。用胶头滴管将研钵中的提取液转移至分液漏斗中，加入10.0 mL正己烷和10.0 mL 10%氯化钠水溶液，振摇，静置。分去水层，有机层用10.0 mL 10%氯化钠溶液水洗两次，然后将有机层用无水硫酸钠干燥。将干燥好的提取液转移至另一容器中。若溶液颜色较浅，可适当浓缩。

薄层色谱法可以快速进行物质的分离、鉴定。本实验选用青岛海洋化工有限公司的薄层色谱板(25 mm × 75 mm)，在点样后将其放入装有适量展开剂的层析缸中进行菠菜叶各色素的分离、鉴定。

柱色谱法是分离、提纯有机物的重要方法。本实验分别讨论了硅胶、中性氧化铝两种固定相和多种不同组合的流动相，通过不断调整流动相的极性，探索0.5 mL菠菜提取液各色素组分的最佳分离条件。

为了寻找最优的薄层方案，我们首先对已报道的正己烷-丙酮^{[14, 15, 17, 18, 21]}、正己烷-乙酸乙酯^{[18, 24]}两种常用展开剂组合进行了尝试，其次探究了二氯甲烷-乙酸乙酯、正己烷-正丁醇、正己烷-无水乙醇等多种新展开剂，通过观察色素点展开情况，优化展开剂极性大小，以期实现菠菜叶色素的最佳分离效果。

正己烷-丙酮是菠菜叶色素的提取与分离实验中最为常见的薄层色谱展开剂。我们系统分析了已报道的体积比4.0 : 1.0^{[15, 17, 18]}、8.0 : 3.0^[14]、5.0 : 2.0^[21]、7.0 : 3.0^[24]、3.0 : 2.0^[14]的正己烷-丙酮组合，比较不同的展开剂对菠菜叶色素分离效果的影响。实验结果见表 1，当正己烷-丙酮体积比为5.0 : 2.0、7.0 : 3.0时，得到6个色素点，分离效果相对较好，其中7.0 : 3.0时色素点分布更均匀(图 2a)。

正己烷-乙酸乙酯同样是较为常见的薄层色谱展开剂。采用正己烷-乙酸乙酯体积比为3.0 : 2.0^{[18, 25]}、5.0 : 4.0^[23]的混合溶液对菠菜叶色素进行薄层色谱分离实验。如表 1所示，正己烷-乙酸乙酯5.0 : 4.0时得到最多的色素点，但各色素点拖尾严重(图 2b)。我们另外又尝试了正己烷-乙酸乙酯6.0 : 5.0、5.0 : 3.0、2.8 : 1.5、3.0 : 1.4的混合比例，均未能得到好的色素分离效果。

为了进一步优化薄层色谱分离方案，我们还尝试了“菠菜叶中色素提取与分离实验”未曾使用过的新展开剂组合如二氯甲烷-乙酸乙酯、正己烷-正丁醇、正己烷-无水乙醇等，通过系统分析不同展开剂作用下的色素点分离情况，优化展开剂极性大小，以期实现菠菜叶色素的最佳分离。

以二氯甲烷-乙酸乙酯作为展开剂，我们依次尝试了体积比5.0 : 2.0、2.0 : 1.0、3.0 : 2.0、1.0 : 1.0的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶液对薄层分离效果的影响。如表 2所示，二氯甲烷-乙酸乙酯体积比为2.0 : 1.0、3.0 : 2.0时，得到了6个色素点，分离出的色素点最多，其中体积比为2.0 : 1.0时色素点分布更加均匀(图 3a)。

以正己烷-正丁醇作为展开剂，我们依次比较了正己烷-正丁醇体积比为5.0 : 1.0、7.0 : 1.0、12.0 : 1.0、13.0 : 1.0、14.0 : 1.0、15.0 : 1.0、18.0 : 1.0的混合溶液。如表 2所示，当展开剂为13.0 : 1.0、15.0 : 1.0时，得到了7个色素点，15.0 : 1.0时色素点出现拖尾现象(图 3b)，13.0 : 1.0时色素点分离效果更好(图 3c)。

以正己烷-无水乙醇作为展开剂，我们依次尝试了体积比为5.0 : 4.0、2.0 : 1.0、9.0 : 1.0、10.0 : 1.0、11.0 : 1.0、12.0 : 1.0、13.0 : 1.0的正己烷-无水乙醇混合溶液。如表 2所示，当正己烷-无水乙醇体积比为10.0 : 1.0、11.0 : 1.0、12.0 : 1.0、13.0 : 1.0时，菠菜叶中不同色素可以实现较好分离，均出现8个色素点。其中，10.0 : 1.0时色素点分布相对均匀(图 3d)，分离出4个叶绿素色素点，色素点均无明显拖尾。但随着展开剂极性的进一步降低，从11.0 : 1.0比例开始，叶黄素的分离效果逐渐变差(图 3e)。

另外，我们还尝试了正己烷-甲醇、二氯甲烷-甲醇、四氯化碳-乙酸乙酯作为薄层色谱分离实验的展开剂，但均未取得较好的分离效果。

综上所述，分别得到了薄层色谱实验中不同展开剂组合的最佳比例及分离效果(表 3)。比较发现，展开剂为体积比10.0 : 1.0的正己烷-无水乙醇时，色素分离效果好，出现色素点最多，色素点无明显拖尾现象，其次是体积比13.0 : 1.0的正己烷-正丁醇溶液。

在本科教学阶段，柱色谱分离实验通常选用硅胶或中性氧化铝作为固定相，选用有机混合溶液作为流动相。在前期的薄层色谱实验中，已经得到了菠菜叶中色素分离效果较好的薄层色谱展开剂组合：正己烷-无水乙醇和正己烷-正丁醇。因此，本部分以硅胶或中性氧化铝为固定相，分别选择正己烷-无水乙醇、正己烷-正丁醇的混合试剂作为流动相，通过不断调整试剂的组合比例，探索能清晰分离各种色素且试剂用量少、洗脱时间短的流动相组合，从而得到相对理想的柱色谱实验方案。

我们首先尝试了Isac-Garcia等人的实验方案^[24]，采用体积比为7.0 : 3.0的石油醚-丙酮进行洗脱，分离得到了三个色素组分：胡萝卜素、叶绿素、叶黄素混合液，消耗试剂共计210 mL，耗时160 min。

以正己烷-无水乙醇作为洗脱剂，分别尝试体积比为10.0 : 1.0、20.0 : 1.0、30.0 : 1.0的溶液组合。当体积比为10.0 : 1.0时，洗脱剂极性适中，各色素可以分离；当体积比为20.0 : 1.0、30.0 : 1.0时，洗脱剂极性过小，叶绿素和叶黄素色带连在一起无法分离。在正己烷-无水乙醇10 : 1的基础上，进一步尝试梯度洗脱方法，如表 4第1组实验，依次选择10.0 : 1.0、5.0 : 1.0、0.0 : 1.0的正己烷-无水乙醇进行梯度洗脱，分别得到了胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素1、叶黄素2、叶黄素3，共六种色素组分(图 4a)，消耗试剂180.0 mL，洗脱用时180 min。

以正己烷-正丁醇作为洗脱剂，分别使用体积比为13.0 : 1.0、14.0 : 1.0、16.0 : 1.0、18.0 : 1.0、20.0 : 1.0、22.0 : 1.0、24.0 : 1.0的溶液组合。当体积比为13.0 : 1.0、14.0 : 1.0、和16.0 : 1.0时，洗脱剂极性过大，各色素混合，无法分离；当体积比为18.0 : 1.0、20.0 : 1.0时，只能分离得到胡萝卜素和叶绿素；当体积比为22.0 : 1.0和24.0 : 1.0时，胡萝卜素、叶绿素、叶黄素可以完全分离。进一步对22.0 : 1.0的流动相进行优化，如表 4第2组实验，依次使用22.0 : 1.0、15.0 : 1.0、1.0 : 1.0正己烷-正丁醇进行梯度洗脱，分别得到了胡萝卜素、叶绿素、第一个叶黄素、第二个和第三个混合之后的叶黄素组分，共四种色素组分(图 4b)，消耗试剂158.0 mL，洗脱用时230 min。

综上所述，正己烷-无水乙醇体积比为10.0 : 1.0、5.0 : 1.0和0.0 : 1.0的梯度洗脱方法，可以洗脱出六种色素，消耗试剂180.0 mL，耗时180 min。正己烷-正丁醇作为流动相时，洗脱出四种色素组分，消耗试剂158.0 mL，洗脱时间为230 min。因此，以硅胶做固定相，用正己烷-无水乙醇体积比为10.0 : 1.0、5.0 : 1.0和0.0 : 1.0的梯度洗脱方法是更为理想的柱色谱分离方案，此方法耗时短、试剂用量少、分离效果好，有利于教学实验的开展。

以中性氧化铝做固定相，我们首先尝试了已报道的实验方法：参考陈琳等人的实验方案，以正己烷、丙酮、正丁醇、乙醇和水作为洗脱剂(表 5序号1)^[15]，最终得到了四种完全分离的色素组分，消耗试剂86.0 mL，耗时80 min；参考赵剑英等人的实验方案，以正己烷、丙酮和95%的乙醇作为洗脱剂(表 5序号2)^[18]，最终得到了两种色素组分，无法分离叶绿素和叶黄素，消耗试剂137.0 mL，耗时100 min；参考黄超、侯士聪等人的实验方案，以正己烷、丙酮、正丁醇、乙醇和水作为洗脱剂(表 5序号3)^{[14, 20]}，共洗脱出4种色素，消耗试剂35.0 mL，耗时20.5 min。

参考以硅胶为固定相的柱色谱分离实验，我们在中性氧化铝做固定相的实验中，也尝试了正己烷-无水乙醇、正己烷-正丁醇两种洗脱方案。以正己烷-无水乙醇作为洗脱剂，采用体积比为20.0 : 1.0、10.0 : 1.0、5.0 : 1.0的比例进行梯度洗脱，只分离出了胡萝卜素，叶绿素和叶黄素连接在一块，无法分离。进一步调整正己烷-无水乙醇洗脱剂体积比为25.0 : 1.0和30.0 : 1.0，仍然无法实现叶绿素和叶黄素的分离。以正己烷-正丁醇作为洗脱剂，采用体积比为22.0 : 1.0、20.0 : 1.0、1.0 : 1.0的比例进行梯度洗脱，如表 5中4号实验所示，分别得到了胡萝卜素、叶绿素、三个叶黄素组分，共5种色素，试剂消耗量78.0 mL，耗时27 min。

与文献实验进行对比，以中性氧化铝为固定相时，采用体积比为22.0 : 1.0、20.0 : 1.0、1.0 : 1.0的正己烷-正丁醇作为洗脱剂的梯度洗脱方案分离效果最佳，分离得到了最多的色素组分，所用展开剂种类少，实验用时较短，更适合进行实验教学。

综上所述，我们得到了柱色谱实验的两个最优方案(表 6)：1) 以12.0 g硅胶做固定相，分别用110.0 mL 10.0 : 1.0、60.0 mL 5.0 : 1.0和10.0 mL 0.0 : 1.0正己烷-无水乙醇进行梯度洗脱，可以分别得到6种色素组分，消耗试剂180.0 mL，实验耗时180 min。2) 以15.0 g中性氧化铝做固定相，分别用35.0 mL 22.0 : 1.0、21.0 mL 20.0 : 1.0和22.0 mL 1.0 : 1.0正己烷-正丁醇进行梯度洗脱，可以分离得到5种色素组分，试剂消耗量78.0 mL，耗时27 min。但是，如图 5所示，以氧化铝做固定相时，各色素在色谱柱中显色不明显，难以观察色谱柱中各色素带的分离情况。

本实验系统探究了菠菜叶色素的提取与分离教学实验，优化了薄层色谱展开剂和柱色谱洗脱剂，得到了更佳的薄层色谱、柱色谱分离效果。薄层色谱实验中选用体积比为10.0 : 1.0的正己烷-无水乙醇作展开剂可以得到8个色素分离点，实验分离效果最佳。柱色谱实验中选用硅胶为固定相，分别用体积比为10.0 : 1.0、5.0 : 1.0、0.0 : 1.0正己烷-无水乙醇进行梯度洗脱，或者选用中性氧化铝为固定相，分别用体积比为22.0 : 1.0、20.0 : 1.0、1.0 : 1.0正己烷-正丁醇进行梯度洗脱，都可以得到较好的色素分离效果。此次实验改进，进一步提高了色素分离效果，减少了管制试剂及毒性较大试剂的使用，缩短了实验时间，对该实验在实际教学中进一步的推广应用具有重要意义。