复方阿司匹林片(APC)的三个有效成分分别是乙酰水杨酸(阿司匹林，A)、乙酰对氨苯乙醚(非那西丁，P)和1, 3, 7-三甲基黄嘌呤(咖啡因，C)，其中乙酰水杨酸具有解热、镇痛、抗炎、抗癌及抗风湿等作用，加入少量咖啡因可加强阿司匹林片的药效作用^{[1, 2]}。

仪器分析结合数学、物理、光学、机械及计算机等知识和技术，具有高效、正确、灵敏度高等优点，被广泛应用于临床医学诊断、食品及环境安全检测等，仪器分析实验也是医学预防及检验等专业的重要基础课。本实验设计了利用高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)和超高效合相色谱仪(Ultra Performance Convergence Chromatography，UPC²或UPCC)，分别“测定复方阿司匹林片中乙酰水杨酸和咖啡因含量”的教学方案，通过比较教学法分析两种方法的实验原理、操作要点等。该实验提高了学生的观察力、思维能力、理解力、学习兴趣，从而提升学习效果及培养其创新意识^{[3, 4]}。在教学过程中，结合教学内容充分挖掘、引入思政元素，包括学术诚信、爱国情怀等案例^{[5, 6]}，培养正确的社会主义核心价值观。

仪器：超高效合相色谱仪(ACQUITY UPC²，Waters公司，美国)，高效液相色谱仪(Agilent1260，Agilent公司，美国)，XS105电子分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)，USC-302超声波清洗仪(上海波龙电子设备有限公司)，纯水仪(Thermo公司，美国)。色谱柱1 (ACQUITY UPC^2TM BEH合相色谱柱3.0 × 100 mm，1.7 µm，Waters公司，美国)；色谱柱2 (ZORBAX Eclipse Plus C18液相色谱柱4.6 × 100 mm，3.5 µm，Agilent公司，美国)。

试剂：咖啡因标准品(分析纯，上海试剂二厂)，乙酰水杨酸标准品(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，复方阿司匹林片(西安利君制药有限责任公司)。甲醇(色谱纯，TEDIA，美国)，二氧化碳(食品级，上海成功气体工业有限公司)。

准确称取咖啡因约10.00 mg于100 mL容量瓶中，加80 mL甲醇超声溶解，用甲醇定容至刻度，制成浓度为100 μg∙mL⁻¹标准溶液。

准确称取阿司匹林约30.00 mg和咖啡因约10.00 mg于100 mL容量瓶中，加80 mL甲醇超声溶解，用甲醇定容至刻度得乙酰水杨酸浓度和咖啡因浓度分别为300 μg∙mL⁻¹和100 μg∙mL⁻¹混合标准液储备液。分别移取1.00、2.00、3.00、4.00 mL储备液移入4个10 mL容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，配成乙酰水杨酸浓度为30、60、90、120、300 μg∙mL⁻¹及咖啡因为10、20、30、40、100 μg∙mL⁻¹的混合系列标准溶液。

将1片复方阿司匹林片称量后于研钵中研细，准确称取约10.00 mg粉末于50 mL的容量瓶中，加入40 mL甲醇超声溶解，用甲醇定容至刻度。用一次性过滤针吸取0.8 mL溶液，0.22 µL滤膜过滤至样品瓶中，得供试品液供测试用。

HPLC色谱条件：色谱柱(ZORBAX Eclipse Plus C18柱4.6 × 100 mm，3.5 µm)，流动相：甲醇-1%乙酸水溶液(50 : 50，体积比)，流速：1.0 mL∙min⁻¹；检测波长：276 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 µL。

UPC²色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPC^2TM BEH柱(3.0 × 100 mm，1.7 µm)；流动相：甲醇-超临界二氧化碳(10 : 90，体积比)，流速：1.0 mL∙min⁻¹；检测波长：276 nm；柱温：25 ℃；系统背压1700 Psi；进样量：1 µL。

本实验为3学时，实验对象为医学预防专业学生。每六人共用一台HPLC仪和一台UPC²仪，分为两组，每组三人交叉使用仪器。

本实验预习阶段，提前三周在班级微信群中发布学习任务，要求学生登录超星学习通(PC端或手机端)观看相关的学习资料(包括HPLC及UPC²的原理视频、PPT、动画)，完成虚拟实验操作及思考题，由后台记录学习完成度，学生超星平台上提交实验预习报告后方能进入实验室。期间教师通过微信群或超星学习通为学生答疑解惑。

分别取空白甲醇、咖啡因标准液、混合标准对照液(取2号浓度)和供试品液按1.3小节中色谱条件分别测定，记录色谱图(图 1为HPLC色谱图，图 2为UPC²色谱图)。

HPLC色谱图中，乙酰水杨酸和咖啡因出峰时间分别约2.26、1.39 min；而UPC²色谱图中，乙酰水杨酸和咖啡因出峰时间分别约1.05、1.28 min。乙酰水杨酸和咖啡因都能完全分开且峰形良好，甲醇空白不会产生干扰，样品液中也无其他杂质峰干扰，表明方法的专属性良好，符合定量分析要求。

在HPLC和UPC²各自色谱条件下，取5号混合标准液连续进样5次，计算保留时间和峰面积的相对平均偏差值(RSD)考察仪器精密度。HPLC结果显示，咖啡因保留时间和峰面积RSD分别为0.04%、0.8%；乙酰水杨酸保留时间和峰面积RSD分别为0.03%、0.9%。UPC²结果显示，咖啡因保留时间和峰面积RSD分别为0.2%、0.5%；乙酰水杨酸保留时间和峰面积RSD分别为0.3%、0.7%。表明仪器精密度达到测试要求(图 3分别为HPLC 5次进样的镜像对照图和UPC² 5次进样的叠加图)。

在1.3小节色谱条件下分别进行测定，以浓度X与对应的色谱峰面积Y进行线性拟合得回归方程。结果显示，30–300 μg∙mL⁻¹ (乙酰水杨酸)和10–100 μg∙mL⁻¹ (咖啡因)浓度范围内(实际浓度见表 1和表 2)，线性关系良好。

供试液分别进样HPLC和UPC²得色谱图，利用回归方程计算含量，换算后得出药片中乙酰水杨酸和咖啡因含量。

本次实验设计中，学生对仪器的熟练操控和应用软件学习尤为重要。因此，软件深度开发使用也是本次实验教学的重点。重叠信号(3D重叠，镜像重叠)不仅能直观地观察信号的保留时间和峰面积的重复性，而且在实际科研中也很有用。例如，中药的指纹图谱研究，不同色谱条件下的分离情况研究，通过信号叠加可清晰地进行比较观察，从而得到相关研究信息，如将其用于PPT汇报中，更生动有说服力。软件中“积分事件”可教会学生根据色谱峰的实际情况选择合理的积分方法(基线积分、切线积分、手动积分等)；而“序列表建立”能教会学生通过建立序列表，运行序列进行全自动的分析。利用二极管阵列(DDA)检测器扫描，从色谱图上提取紫外光谱图(图 4和图 5)、3D扫描图及利用软件进行色谱峰的纯度检查，这些软件技术的掌握有助于提升学生对大型仪器的操作技能开展。而从综合性报告中直接得信噪比、理论塔板数、分离度等参数，可帮助学生提高工作效率。

HPLC仪和UPC²仪都能将混合物经色谱柱分离为各个单一的纯化合物，并进行定性和定量分析，两者的色谱理论和色谱软件相同。但UPC²采用无毒超临界CO₂和少量甲醇为流动相(绿色环保)，色谱柱采用1.7 µm桥式乙烷杂化颗粒为固定相填料(图 6)，与HPLC (3.5 µm普通硅胶颗粒为固定相填料)相比，具有更高机械强度、更强分离效果、更宽流速范围。从理论塔板高度(H)与流速(V)间的关系可知(图 7)，小颗粒填料在流速较大的情况下，依然保持较小的理论塔板高度，因此在保持分离度不变的情况下可选择更高流速、更短色谱柱，能缩短分离时间和提高分离效率。

HPLC仪与UPC²仪的应用领域既有交叉又有专属。在检验分析中，UPC²是气相和液相色谱的重要补充，在液相色谱仪较难解决的脂类成分分析、手性化合物对映体分离中表现尤为突出^[7–9]。在反相高效液相色谱分离脂类化合物，往往涉及到样品溶解的问题。而手性样品手性分离通常在正相条件下进行(反相色谱分离效果差)，这将消耗大量昂贵的有机溶剂(正己烷、异丙醇等)，且不利于环保。UPC²以超临界二氧化碳和少量有机溶剂为流动相，不仅出峰时间快，分离效果好，而且环保、运行成本低。本实验中，学生发现乙酰水杨酸和咖啡因的色谱峰出峰顺序在两种图谱中相反，HPLC色谱图中咖啡因在前、乙酰水杨酸在后；而UPC²色谱图中乙酰水杨酸在前、咖啡因在后(图 1和图 2)。通过比较教学，学生能认识到不同色谱条件会影响样品的出峰时间，甚至会出现顺序相反(保留时间和分离选择性受流动相组成及色谱柱而变化)，但不影响测定结果。在实验过程中学生还能发现，药片中虽乙酰水杨酸比咖啡因的含量高很多，但色谱图上其色谱峰比咖啡因反而小，原因是276 nm波长下，咖啡因的紫外吸收强度大于乙酰水杨酸(图 4和图 5)。因此，通过直观的比较学习，有利于提高学生对知识的理解。

液相色谱虽能分离混合物和定量检测，但成分定性需有标准品。如本实验中非那西丁没有标准品，虽可利用DAD检测器的光谱扫描获取紫外光谱图进行定性，但紫外光谱相似的化合物很多，故有局限性。如采用液相-质谱联用仪可增强其定性检测能力，因此，实验过程中可给学生补充介绍液质联用(LC-MS-MS)的基本知识，包括四极杆质量分析器的原理和定性分析原理。拓展内容的引入，可以增加学生的学习兴趣，培养其探索精神。

色谱分析仪在药品开发、食品安全和环境监测等科研领域广泛应用。在实验数据记录与处理过程中，引导学生要诚信对待，虚假和错误的数据不仅得不到预料的成果，甚至会导致错误结论。可以引用媒体报道案例，如新冠疫情流行时，某些检测核酸单位为私利出具虚假报告，一定程度上误导了国家的抗疫决策。教育学生不仅要有过硬的技能和知识，更要有高度的社会责任感和职业道德素养^[10]。

教学中通过两种仪器方法学比较，使学生认识到事物都有二面性^[11]。UPC²仪虽然检测效率高、绿色环保，但仪器制造技术要求高、价格昂贵，且相比HPLC仪可联用的检测器种类也少^[12]。HPLC仪价格相对便宜，根据分析需要可选的色谱柱、流动相及检测器种类多。因此应根据实际工作的需要购买仪器，不要为了追求高大上而浪费国家的外汇。

色谱分析的科研文献中大多使用进口仪器(美国Waters公司、美国Agilent公司，日本岛津公司等)，虽然国产HPLC、气相色谱(GC)仪近年也有发展，但LC-MS，气相-质谱联用仪(GC-MS)的国产化产品很少，仪器供应一旦受阻，许多科研领域将面临瘫痪，例如受美国封锁影响手机芯片断供就是一个例证。教学中可介绍中国核潜艇总设计师黄旭华院士的案例，他通过拆解儿童核潜艇模型，研究掌握了我国第一代核潜艇的重要数据。激发学生的爱国情怀、创业精神及民族自豪感，自觉担任起中华复兴的历史使命。

本实验中学生不仅能掌握两种色谱仪的操作技术，而且也能了解前沿仪器的发展状况及在科研中的应用，提升综合实践能力。大型精密仪器应用于实验教学，不仅有助于发挥其在培养高素质人才中的作用^{[13, 14]}，也提高了仪器的使用率，符合学校对大型仪器的管理要求^{[15, 16]}。本实验的设计内容为多组分样品含量测定，更符合实际分析工作需求，还能使同学对色谱仪分离复杂混合物并定性、定量分析的能力有更深刻的理解。通过利用两种仪器对相同样品进行测试结果的对比和互相验证，学生充分了解仪器测试的正确性和可靠性。色谱技术是专业性很强的实用技术，近年来其相关应用的发展突飞猛进，在实验课上同时介绍一些拓展性新知识、新技术，能提高学生的学习兴趣，拓展学生的视野。本实验教学的实践显示，通过比较法学习学生可将知识点串联起来，大大提高学习效率，达到事半功倍的效果^[17]。