维生素B₂ (Vitamin B₂，简称VB₂)是一种水溶性维生素，是人体内很多重要酶的组成成分，在维持人体代谢中起着重要作用。缺乏VB₂会影响人体细胞的生长和机体的生物氧化，使代谢发生障碍，导致口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等^[1–3]。由于人体自身无法产生VB₂，只能通过食物等外界来源摄取，因此对食源性VB₂的研究具有重要意义。

VB₂的分子式为C₁₇H₂₀N₄O₆，拥有三个芳香环(图 1)。分子的平面刚性结构赋予了VB₂较强的荧光性质，其最大的荧光发射波长大约在525 nm左右。“荧光法测定VB₂的含量”是很多大学仪器分析课程的常用本科教学实验^[4]。其基本的实验流程是在最佳的激发和发射波长下测定VB₂标准溶液的荧光强度，利用荧光强度与浓度的线性关系制作标准曲线。在相同条件下测定未知溶液的荧光强度，并利用制作的标准曲线计算出未知溶液中VB₂的含量。通过该实验，可以加深学生对分子荧光的理解，了解荧光光谱仪的基本结构，掌握仪器的基本使用步骤及荧光定量分析的基本操作，对于辅助仪器分析教学至关重要。但作为一个本科教学实验，其设计过于简单、实验内容偏少，学生往往很快就完成了全部实验内容。不仅使学生得不到充分的锻炼，而且无法凸显荧光分析法在人类生产和生活中的强大实际应用能力。为此，在原有实验内容的基础上开展进一步设计，拓展实验项目，开发内容更为丰富、且实验时间和操作难度适宜的本科教学实验，对于提升实验教学效果至关重要。

很多食物，包括动物肝脏、肉类、蛋类、奶及奶制品中都含有大量的VB₂。蔬菜也是人们获取VB₂的一个重要来源，部分蔬菜的VB₂含量如表 1所示。菠菜是一种比较常见的蔬菜，每100 g菠菜中VB₂的含量大约为0.11 mg ^[5]，属于VB₂含量较高的绿色蔬菜。但由于菠菜中含有大量的草酸(0.2–0.3 g/100 g)，食用之后会与人体内的钙、镁发生反应，生成草酸钙和草酸镁等难以消化的物质。不仅不利于人体健康，长期食用还有可能引发结石。因此，在食用前通常需要对菠菜进行焯水处理以去除草酸^[6]，这一过程不可避免地会造成VB₂的流失。本实验证明，利用荧光分析法可以考察菠菜焯水过程中VB₂的析出情况。相关实验有望作为目前本科教学实验的一个拓展，不仅可以丰富教学内容，而且使实验更加贴近于人们的实际生活。有助于提升学生的学习兴趣，加深对所学内容的理解。

荧光是一种光致发光现象。荧光物质分子在吸收了特定波长的紫外光或可见光能量之后，从基态跃迁至相应的激发态。在通过振动驰豫和内转化等非辐射途径损失掉一部分能量后，积累到第一电子激发单重态的最低振动能级，再从该能级向基态的各个振动能级跃迁，产生分子荧光。在一定浓度范围内，荧光强度(F)与荧光物质浓度(C)之间成正比关系(F = kC)，借此可以进行定量分析。

能够发出荧光的物质通常具有刚性平面和大共轭结构。VB₂分子中由于存在由三个芳香环构成的共轭体系，且结构刚性，因此显示了良好的荧光性质。利用VB₂产生的荧光信号，可以对菠菜焯水过程中释放出来的VB₂进行定量分析，进而计算出该过程中VB₂的流失率。

1.00 μg∙mL⁻¹ VB₂标准贮备液：准确称取1.00 mg VB₂，将其溶解于含有1%乙酸的蒸馏水中。转移至1 L容量瓶，并用含有1%乙酸的蒸馏水定容至刻度、摇匀。分装于棕色瓶中避光保存备用。

新鲜菠菜叶片：购于当地菜市场。

Shimadzu RF-5301PC型荧光光谱仪(日本岛津)、电加热套、Sartorius电子天平(德国赛多利斯)、25 mL比色管、10 mL离心管、5 mL移液管、500 mL锥形瓶、移液器。

准确移取0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL的VB₂标准贮备液于25 mL比色管中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

(1) 选取新鲜的菠菜叶片，洗净，用吸水纸去除表面水分，晾干或用吹风机吹干备用。

(2) 向500 mL锥形瓶中加入400 mL蒸馏水，在电热套上加热至沸腾。此过程中将锥形瓶盖上锡纸以减少热量和水分损失。

(3) 准确称取40 g左右菠菜叶片，并快速加入至锥形瓶中，开始计时。每1 min用移液器从中取出2.5 mL水溶液至离心管中，冷却至室温备用。5 min后停止加热，此时取出两份水溶液，一份编号入上述的取出液系列，一份用于绘制取出液的荧光光谱。

从1.4.1配制的标准溶液中选取一个浓度较大的用于荧光光谱的绘制。具体步骤如下：以525 nm作为发射波长绘制激发光谱，确定最佳激发波长。再用该激发波长绘制发射光谱，确定最佳发射波长。使用相同的步骤，绘制焯水5 min取出液的激发和发射光谱，并确定其最佳激发波长和最佳发射波长。此过程中，激发和发射狭缝分别设置为5 nm和3 nm。

分别选取463 nm和526 nm为激发和发射波长，依次测定1.4.1中VB₂标准系列溶液的荧光强度。以荧光强度为纵坐标，VB₂浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同激发和发射波长下，测定1.4.2中每个焯水时间点下取出液的荧光强度。利用绘制的标准曲线计算出各取出液中VB₂的浓度，进而计算出各个时间点下析出的VB₂质量及流失百分率。

$\mathrm{VB}_2 \text { 流失百分率 }=\frac{\text { 析出的 } \mathrm{VB}_2 \text { 质量 }}{\text { 菠菜中 } \mathrm{VB}_2 \text { 总质量 }} \times 100 \%$

其中，菠菜中VB₂总质量按每100 g菠菜中含0.11 mg VB₂计算。

VB₂为水溶性维生素，室温下的溶解度为12 mg/100 mL。加热时，VB₂在中性或酸性条件下具有较高的稳定性。也就是说，在焯水过程中，菠菜中的VB₂可以释放到热水中，并在热水中稳定存在。因此可以推测，利用荧光分析法，可以对焯水过程中释放到水里的VB₂含量变化进行监测，进而计算出VB₂析出量随焯水时间的变化。为证明这一点，准确称取一定量(40.45 g)的菠菜进行焯水处理(图 2)。为减少焯水过程中因水分蒸发所造成的体积损失，选用锥形瓶作为容器，并在实验过程中用锡纸密封锥形瓶口，只在取样时短暂打开。选取焯水5 min的取出液进行荧光光谱的绘制，并与VB₂标准溶液进行对比。结果如图 3所示，该取出液具有荧光性质，其最大激发波长(λ_ex)和最大发射波长(λ_em)分别为463 nm和525 nm，与VB₂标准溶液(λ_ex = 466 nm，λ_em = 526 nm)非常接近。虽然菠菜中同时存在草酸、维生素C、维生素E、胡萝卜素和视黄醇等物质，但它们或者没有荧光，或者激发波长和发射波长与VB₂差别较大。因此可以推断，图 3b中所示的荧光信号是由菠菜焯水过程中析出的VB₂所引起的。利用荧光光谱，可以对析出的VB₂进行定量检测。

测定VB₂标准系列溶液的荧光强度，并绘制标准曲线。由于VB₂标准溶液与菠菜焯水取出液的最大激发波长和发射波长略有不同，为使绘制的标准曲线适用于菠菜焯水取出液中VB₂的定量分析，对激发和发射波长进行了折中选取。从图 3可以看出，无论是标准溶液还是焯水取出液，在激发光谱中，荧光强度在最大激发波长前变化较缓，在最大激发波长后迅速下降，因此选择较小的463 nm作为激发波长。由于荧光光谱的对称性，发射光谱给出了相反的趋势，即荧光强度在最大发射波长前变化较大，在最大发射波长后变化减缓，因此选择较大的526 nm作为发射波长。在选取的激发和发射波长下，绘制的标准曲线如图 4所示。在0.02–0.10 μg∙mL⁻¹的浓度范围内，荧光强度与VB₂浓度呈现良好的线性关系。线性回归方程为F = 5203.13C (μg∙mL⁻¹) − 1.96，线性相关系数(R²)为0.9987。

将不同焯水时间点的取出液冷却至室温，在与绘制标准曲线相同的实验条件下测定荧光强度，并利用前面得到的标准曲线计算出每个时间点下取出液中VB₂的浓度，进而计算出该时间点下VB₂的总析出量。注意，在进行VB₂总析出量计算时，需要把前面各时间点取出液中含有的VB₂计算在内。举例而言，计算焯水3 min时VB₂的总析出量，需要加上第1 min和第2 min取出液(各2.5 mL)里的VB₂ (各自时间点下取出液中VB₂浓度× 2.5 mL)。以每100 g菠菜中含有0.11 mg VB₂计算，40.45 g菠菜中含有的VB₂总量为0.04450 mg (44.50 μg)。利用此数据，可以计算出各个时间点下VB₂的流失率。从表 2和图 5可以看出，在焯水过程中，VB₂快速从菠菜中析出。在焯水1 min和2 min时，VB₂的析出百分率分别为44.65%和62.74%。在0到1 min的时间段，VB₂的析出速率最快。在1到2 min的时间段，仍保留了较快的析出。其中一个原因是当菠菜刚加入沸水中时，会使体系的温度下降。也就是说，在开始的1 min内，有一段时间锥形瓶中的水并没有处于沸腾状态，导致VB₂未能充分析出。2 min后，VB₂的析出速率变缓。当焯水时间为5 min时，VB₂的析出百分率为73.82%。将焯水时间继续延长至10 min时，VB₂的析出百分率达到76.66%。从以上结果可以看出，由于VB₂在沸水中具有较高的溶解度，在焯水过程中，VB₂极易从菠菜中析出。当焯水时间为3 min时，大约2/3的VB₂将会进入到水中而流失。当焯水时间为5 min时，大约3/4的VB₂将会析出。在此基础上继续延长焯水时间，对VB₂的析出影响不大。考虑到人们在实际生活中并不会对菠菜进行过长时间的焯水，大约有1/2–1/3的VB₂会保留在菠菜当中。从以上实验结果可以看出，虽然菠菜是VB₂含量相对较高的一种绿色蔬菜，但由于食用前往往需要焯水处理以去除草酸，会造成一半以上的VB₂流失，导致人们实际摄入的VB₂并不多。平行进行三组实验以验证分析结果的重现性。实验结果表明(图 5)，该方法重现性良好，除在VB₂快速析出阶段(0–3 min)相对偏差较大外(~7%)，其他阶段，尤其是析出平衡阶段，偏差均在5%以内。

该实验可以有效克服原有实验内容偏少、学生得不到充分锻炼的问题。在原有实验基础上加入本部分内容后，全部实验可以在4个学时之内完成。另外，该部分实验内容对仪器设备要求简单，只需要引入化学实验室常备的电子天平、电热套和锥形瓶即可。以上特点使其尤其适用于本科实验教学。在两个学期的试运行中，学生普遍反映良好，被誉为印象最为深刻的仪器分析实验。学生给出了如下评价：实验既贴近生活，易于操作，又新颖有趣，通过实验，我们对理论知识有了更深的理解；实验揭示了有关菠菜焯水过程中维生素的流失情况，对指导我们的生活颇有意义；实验在原有课程实验的基础上，以分析技术证明生活中蔬菜焯水对某些营养素的影响，更加贴近生活；实验对原有课程进行了丰富补充，实验内容安全有趣，能够与日常生活紧密联系，起到对学生在学以致用方面的提示作用；实验生动有趣，与人们的生活密切相关，通过该实验，对将分析技术应用于人类生活有了更为深入的理解。

在证明荧光分析法可以用于分析菠菜焯水过程中VB₂流失情况的基础上，提出将该实验内容丰富到本科教学实验“荧光法测定维生素B₂”的实验教学改革思路。这一改革思路具有如下优点：(1) 丰富了实验内容，克服了原有实验内容偏少、学生锻炼不足的问题；(2) 实验内容新颖有趣，既有利于提升学生的学习兴趣，又有利于加深学生对课堂知识的理解；(3) 研究内容贴近生活，有利于帮助学生培养学以致用的能力；(4) 实验时长适宜，对仪器要求低，使用化学实验室的常备仪器即可完成，尤其适用于推广为本科教学实验。