蛋白质中总巯基的测定及标记

doi:10.3866/PKU.DXHX202111072

大学化学 >> 2022, Vol. 37 >> Issue (5): 2111072.doi: 10.3866/PKU.DXHX202111072

所属专题：第2届全国大学生化学实验创新设计竞赛

蛋白质中总巯基的测定及标记

张保新, 范卓, 于晨昕, 刘喆, 沈永雯, 惠新平, 房建国()

兰州大学化学化工学院, 化学国家级实验教学示范中心, 兰州 730000

收稿日期:2021-11-24 录用日期:2021-12-07 发布日期:2022-04-06
通讯作者: 房建国 E-mail:fangjg@lzu.edu.cn
作者简介:房建国, Email: fangjg@lzu.edu.cn
基金资助:
基金委国家基础科学人才培养基金(J1030416);兰州大学教学研究项目(201118);基础学科拔尖学生培养计划2.0研究课题(20212090)

Labeling and Determination of Total Sulfhydryl Content in Protein

Baoxin Zhang, Zhuo Fan, Chenxin Yu, Zhe Liu, Yongwen Shen, Xinping Hui, Jianguo Fang()

National Demonstration Center for Experimental Education, College of Chemistry and Chemical Engineering, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Received:2021-11-24 Accepted:2021-12-07 Published:2022-04-06
Contact: Jianguo Fang E-mail:fangjg@lzu.edu.cn

摘要/Abstract

摘要：

生物硫醇的检测与蛋白质荧光标记是当今科学研究的热门领域。本实验使用传统的Ellman法及Naph-EA-Mal荧光探针标记法对牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)的巯基进行检测，并利用该探针实现了细胞内巯基的原位标记，使学生对传统方法和前沿热点均有较好的掌握和了解。通过本实验的开展，学生不仅可以清楚了解蛋白三维结构对其所含基团的反应活性的影响，而且可以从化学层面理解硫醇类探针的工作原理及活细胞中生物硫醇的原位成像。实验内容涵盖蛋白质还原、变性、生物大分子与小分子的分离、生物大分子的化学修饰以及活细胞荧光成像等，综合性强且容易操作。教学内容可以实现模块化，便于不同学校根据条件选取相应的教学内容。教学实践不仅可以让学生复习巩固化学生物学知识，也帮助学生了解前沿交叉学科热点，同时在虚拟实验平台开设了补充实验，使得教学更加立体化。

关键词: 蛋白质巯基, Ellman法, 荧光探针, 活细胞成像, 蛋白质的化学修饰

Abstract:

Biological sulfhydryl detection and protein labeling are critical in current scientific research. In this study, the traditional Ellman method and the newly developed Naph-EA-Mal fluorescent probe were used to quantify sulfhydryl groups in bovine serum albumin, thus giving students a better understanding of both traditional methods and cutting-edge technology. The content of sulfhydryl can be detected in situ through measuring the fluorescence intensity. In addition, students gain knowledge regarding the mechanism of thiol probes and the influence of the protein's three-dimensional structure on the reactivity of the sulfhydryl groups within the protein. The experiment covers basic technology of treating cells and different methods of treating biomacromolecules. These methods are comprehensive, modularized, and easy to implement. This lab course will help students obtain cutting-edge chemical biology knowledge. In addition, the experiments on the virtual experiment platform could further help students learn and understand the principles and operational methods used in this experiment.

Key words: Protein sulfhydryl group, Ellman method, Fluorescent probe, Live cell imaging, Protein chemical modifications

张保新, 范卓, 于晨昕, 刘喆, 沈永雯, 惠新平, 房建国. 蛋白质中总巯基的测定及标记[J]. 大学化学, 2022, 37(5): 2111072.

Baoxin Zhang, Zhuo Fan, Chenxin Yu, Zhe Liu, Yongwen Shen, Xinping Hui, Jianguo Fang. Labeling and Determination of Total Sulfhydryl Content in Protein[J]. University Chemistry, 2022, 37(5): 2111072.

链接本文: https://www.dxhx.pku.edu.cn/CN/10.3866/PKU.DXHX202111072

https://www.dxhx.pku.edu.cn/CN/Y2022/V37/I5/2111072

图/表 10

图1

图2

图3

表1

表2

图4

表3

图5

图6

表4

参考文献 8

1	Zhang S. ; Ong C. N. ; Shen H. M. Cancer Lett. 2004, 208, 143. doi: 10.1016/j.canlet.2003.11.028
2	Chen X. ; Zhou Y. ; Peng X. ; Yoon J. Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 2120. doi: 10.1039/b925092a
3	Yin C. ; Huo F. ; Zhang J. ; Martinez-Manez R. ; Yang Y. ; Lv H. ; Li S. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 6032. doi: 10.1039/c3cs60055f
4	Wang W. ; Rusin O. ; Xu X. ; Kim K. K. ; Escobedo J. O. ; Fakayode S. O. ; Fletcher K. A. ; Lowry M. ; Schowalter C. M. ; Lawrence C. M. ; et al J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 15949. doi: 10.1021/ja054962n
5	Yin J. ; Kwon Y. ; Kim D. ; Lee D. ; Kim G. ; Hu Y. ; Ryuand J. H. ; Yoon J. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 5351. doi: 10.1021/ja412628z
6	Ellman G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70. doi: 10.1016/0003-9861(59)90090-6
7	Sun J. ; Zhang L. ; Zhang X. ; Hu Y. ; Ge C. ; Fang J. Analyst 2016, 141, 2009. doi: 10.1039/C5AN02347E
8	Eyer P. ; Worek F. ; Kiderlen D. ; Sinko G. ; Stuglin A. ; Simeon-Rudolf V. ; Reiner E. Anal. Biochem. 2003, 312, 224. doi: 10.1016/S0003-2697(02)00506-7

试剂名称	纯度	制造商
牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)	≥ 99%	上海碧云天生物技术有限公司
十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)	≥ 99%	西格玛奥德里奇贸易有限公司
过硫酸铵(Ammonium Persulfate, AP)	98%	北京伊诺凯科技有限公司
四甲基乙二胺(N, N, N’, N’-Tetramethylethylenediamine, TEMED)	≥ 99%	百灵威科技有限公司
5, 5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (5, 5’-Dithio bis-(2-Nitrobenzoic Acid)，DTNB)	98%	上海麦克林生化科技有限公司
1, 4-二硫代苏糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)	≥ 99%	西格玛奥德里奇贸易有限公司
盐酸胍(Guanidine Hydrochloride, G-HCl)	≥ 99%	北京伊诺凯科技有限公司
考马斯亮蓝G-250 (Coomassie Brilliant Blue G-250, CBB)	≥ 99%	梯希爱(上海)化成工业发展有限公司
葡聚糖凝胶(Sephadex G-25)	–	上海语燕生物科技有限公司
三(羟甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane, Tris)	≥ 99%	西格玛奥德里奇贸易有限公司
L-半胱氨酸(L-Cysteine, Cys)	≥99%	西格玛奥德里奇贸易有限公司
二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)	≥ 99%	北京伊诺凯科技有限公司
乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA)	≥ 99%	北京伊诺凯科技有限公司
N-乙基马来酰亚胺(N-Ethylmaleimide, NEM)	≥ 99%	阿法埃莎(中国)化学有限公司
丙酮(Acetone)	≥ 99%	阿法埃莎(中国)化学有限公司
溴酚蓝(Bromophenol Blue, BPB)	98%	上海麦克林生化科技有限公司

仪器名称	型号	制造商
分析天平	XS105	梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司
干式恒温器	GL-150B	其林贝尔仪器制造有限公司
恒温摇床	SPH-1038	上海世平实验设备有限公司
涡旋振荡器	QL-901 Vortex	其林贝尔仪器制造有限公司
电泳仪电源	DYY-7C	北京六一生物科技有限公司
电泳槽	JY-SCZ2+	北京君意东方电泳设备有限公司
化学发光/荧光凝胶成像系统	G: BOX Chemi XRQ	基因有限公司
可调微量移液器	Toppette	大龙兴创实验仪器有限公司
酶标仪	Multiskan go	赛默飞世尔科技公司
微型离心机	MLX-104	荷兰Crystal LabPro公司
扫描仪	CanoScan LiDE 220	佳能(中国)有限公司
数显脱色摇床	TS-100	其林贝尔仪器制造有限公司

组别	第一组			第二组			第三组			第四组
盐酸胍	– ^a			+ ^b			–			+
DTT	–			+			+			–
巯基浓度/(mmol?L^?1)	24	24	31	107	196	98	105	103	122	24	34	26
蛋白浓度/(mg?mL^?1)	1.36	1.30	1.69	0.35	0.53	0.29	1.44	1.32	1.60	1.09	1.11	1.52
每分子蛋白中巯基个数	1.13	1.21	1.17	30.25	37.11	33.22	4.69	5.01	4.92	1.43	1.96	1.10
平均值	1.17 ± 0.04			33.52 ± 3.44			4.87 ± 0.16			1.50 ± 0.43
理论值	1			35			1–35			1

序号	实验内容	学时安排
1	教师讲解	1学时
2	蛋白样品制备、凝胶层析柱准备、SDS-PAGE凝胶装置准备	3学时
3	G-25凝胶层析分离、酶标仪检测	2学时
4	SDS-PAGE凝胶电泳、凝胶成像、凝胶染色及脱色	4学时
5	细胞处理、活细胞成像	2学时

[1]	王本花, 姚朝怡, 李一鸣, 刘清, 蓝敏焕, 喻桂朋, 罗一鸣, 宋相志. 一种基于香豆素氟离子荧光探针的合成、表征及性能测试——“科研反哺教学”在有机化学综合实验教学中的探索与实践[J]. 大学化学, 2025, 40(6): 201 -209 .
[2]	孙元芳, 张然, 罗天, 张欣, 王翊如, 黄腾翔, 方宁. 暗场显微镜下的纳米颗粒识别与观测细胞膜上的扩散运动——推荐一个化学测量学实验<[J]. 大学化学, 2025, 40(2): 121 -129 .
[3]	王小青, 卢雯, 徐莉. 天然产物山奈酚的聚集诱导发光特性及在铝离子检测中的应用——推荐一个大学化学综合实验[J]. 大学化学, 2024, 39(1): 157 -165 .
[4]	邓松泉, 龚琪, 唐艳秋, 王楠, 陈芳, 朱丽华, 王靖宇, 王宏. 基于智能手机及机器学习技术对食品中多种抗生素的识别[J]. 大学化学, 2023, 38(8): 177 -185 .
[5]	刘振波, 肖佳月, 刘爽, 姜文硕, 兰欣宇, 贾文萱, 李天愉. BODIPY荧光探针的合成及次氯酸检测的综合实验[J]. 大学化学, 2023, 38(5): 193 -201 .
[6]	马璐瑶, 张钧富, 陈怡橦, 杨通. RGB阵列式荧光传感技术用于检测高原湖泊中多种重金属离子[J]. 大学化学, 2023, 38(4): 78 -87 .
[7]	付世涛, 窦容慧, 李馨, 郭义娜, 张玉苹, 熊辉, 高晓莉, 徐鑫, 王龙. CuAAC点击化学法合成三氮唑结构锌离子探针[J]. 大学化学, 2023, 38(4): 151 -159 .
[8]	宦双燕, 李珂, 张晓兵, 罗伟平, 王玉枝, 尹霞, 任天兵, 高红霞, 梁志武. 肿瘤原位荧光标记技术设计和探索虚拟仿真实验[J]. 大学化学, 2023, 38(11): 171 -179 .
[9]	温莹, 景宁, 阴彩霞. 酯酶荧光探针的研究现状与进展[J]. 大学化学, 2022, 37(3): 2110036 - .
[10]	孙长艳,李文军,陆慧丽. 席夫碱型有机小分子荧光探针的制备与表征——推荐一个综合化学实验[J]. 大学化学, 2020, 35(2): 70 -74 .
[11]	陈蓁蓁,杨燕美,姜中尧,唐波. 生命的神奇元素——硒[J]. 大学化学, 2019, 34(12): 79 -85 .
[12]	何田,顾峥烨,曾雨霏,胡余宗,尹守春. BODIPY基荧光探针的合成、表征及对铜离子的检测——推荐一个大学综合化学实验[J]. 大学化学, 2017, 32(11): 57 -64 .
[13]	段二月,马建功,程鹏. 钆类造影剂的研究进展[J]. 大学化学, 2016, 31(7): 1 -13 .
[14]	李思吾, 李晖. 硫化氢荧光探针[J]. 大学化学, 2014, 29(2): 38 -43 .

蛋白质中总巯基的测定及标记

Labeling and Determination of Total Sulfhydryl Content in Protein

RichHTML

PDF

赞

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 10

参考文献 8

相关文章 14

Metrics

推荐阅读 0